[发明专利]一种应用于溶酶体内HOCl检测的荧光探针的制备及应用

说明书

本发明公开了一种能应用于溶酶体HOCl检测的荧光探针。所述探针以咪唑并[1,5‑a]吡啶作为能量供体，罗丹明作为能量受体，硫代双酰肼结构作为次氯酸的响应基团，吗啉结构为溶酶体定位基团。在HOCl存在条件下，罗丹明基团转变为开环结构，探针同时发射出463 nm和588 nm的荧光，随着次氯酸浓度的增加，588 nm处的荧光逐渐增强，而463 nm处的荧光强度降低，二者的比值（I₅₈₈/I₄₆₃）与次氯酸浓度在一定范围内（0‑3μM）呈良好的线性关系。本发明的探针具有很强的溶酶体靶向能力，能够高选择性、高灵敏地检测溶酶体内次氯酸，具有巨大的应用前景。

技术领域

本发明涉及一种HOCl荧光探针的合成及在溶酶体内HOCl检测方面的应用。

背景技术

生物体内HOCl是过氧化氢与氯离子在髓过氧化物酶的催化下产生的，其在许多生理活动中起着重要的作用。例如，HOCl可以杀灭入侵到生物体的细菌，是生物体自身的天然杀菌剂。但同时，HOCl也是一把“双刃剑”，生物体内过量产生的HOCl会导致关节炎、动脉粥样硬化甚至癌症等疾病。因此，实时监测细胞内次氯酸浓度具有重要的生物学意义。

由于荧光探针具有高灵敏性和选择性、响应快、操作简单、对细胞无损伤等优点，利用荧光探针检测细胞内HOCl的方法得到了快速发展。

然而，大多数HOCl探针是利用单荧光强度高低来测定被检测物浓度，其检测结果易受到环境因素的影响，而造成误差；而比率型荧光探针能够较好地消除外界环境的干扰，因此比率型HOCl荧光探针受到越来越多的关注。

现有文献报道的HOCl荧光探针很少具有细胞器靶向功能，因此并不能实现细胞器内HOCl检测。而溶酶体靶向的次氯酸荧光探针报道则更少。

基于HOCl荧光探针存在的不足之处，发明人设计合成了一种比率型HOCl荧光探针，并在结构中引入溶酶体靶向基团，实现探针分子在细胞内靶向溶酶体作用，并成功应用于溶酶体内HOCl的检测，为溶酶体HOCl异常相关研究提供了新的工具。

发明内容

为了克服现有技术的缺陷，本发明提供一种能够应用于HOCl检测的荧光探针，具有如下结构（RIL）：

本发明所述次氯酸的荧光探针的制备方法，如图1所示：

本发明的所述荧光探针能够用于检测溶液中HOCl。

在HOCl存在条件下，探针分子的硫代双酰肼结构氧化成1,3,4-噁二唑结构，罗丹明基团转变为开环结构，探针同时发射出463 nm和588 nm的荧光，随着次氯酸浓度的增加，588 nm处的荧光逐渐增强，而463 nm处的荧光强度降低，二者的比值（I₅₈₈/I₄₆₃）与次氯酸浓度在一定范围内（0-3 μM）呈良好的线性关系，如图2所示。

本发明所述的荧光探针还能够应用于细胞溶酶体内HOCl检测。

配制本发明所述次氯酸探针的PBS（0.01 M）缓冲溶液与乙醇（V/V = 7:3，pH6.00）的溶液。分别加入一定量金属离子、活性氧和活性氮物种，然后对上述样品进行荧光测试，结果表明探针对次氯酸有良好的选择性，如图3所示。

用LPS处理RAW264.7细胞后，再分别用本发明所述探针和商品化的溶酶体染料Lyso Tracker Deep Red继续孵育，然后进行共聚焦成像分析，结果表明本发明探针可以很好地富集于溶酶体内，如图4所示。

用本发明探针孵育RAW264.7细胞，然后用LPS处理细胞，然后进行共聚焦成像分析，探针蓝色荧光强度降低，而红色荧光强度明显增强，红色/蓝色荧光强度比值增大，因此上述探针可以用于内源性次氯酸的检测，如图5所示。