[发明专利]制备ROSA26基因突变及富含不饱和脂肪酸动物的方法

说明书

本发明公开了制备ROSA26基因突变及富含不饱和脂肪酸动物的方法。本发明公开的突变ROSA26基因的方法采用CRISPR/Cas9系统进行，CRISPR/Cas9系统包括靶向ROSA26基因的sgRNA，sgRNA的靶序列为序列表中序列2的核苷酸序列；该方法通过向受体细胞中导入sgRNA和Cas9以及含有Sfat1基因表达盒的供体DNA实现ROSA26基因的突变。实验证明，利用本发明的方法可以成功敲除ROSA26基因，并定点整合Sfat1基因，最终成功得到表达Sfat1的动物。

技术领域

本发明涉及生物技术领域中，制备ROSA26基因突变及富含不饱和脂肪酸动物的方法。

背景技术

多不饱和脂肪酸(PUFAs)是一类被广泛研究和关注的脂肪酸。PUFAs主要包括ω-6和ω-3PUFAs两种类型，每一种类型都包括多个从短碳链(18C)到长碳链(22C)的、且含有多个不饱和键的脂肪酸。越来越多的研究证明，PUFAs具有广泛的生物学功能，它们参与细胞膜的构成并作为许多细胞应答过程中的信号分子，与人类的多种疾病的发生紧密相关，其适宜的含量对于人类及其他哺乳动物的正常发育和保持良好的健康状况极其重要。ω-6PUFAs从总体上来说对人体意义不大，其过量的摄入反而危害人体健康。ω-3PUFAs已经被证实在预防和治疗心血管疾病、关节炎、癌症等多种疾病方面有着重要作用。其中特别是22碳六烯的DHA和20碳五烯的EPA，对人体健康具有重要的积极意义。

通过转基因技术在猪肉中生产ω-3PUFAs是目前优质猪育种的一个热点和方向。ω-3脂肪酸去饱和酶基因是ω-3PUFAs合成的关键基因，它们利用ω-6PUFAs为底物在脂肪酸碳链甲基端第三个碳催化生成一个不饱和键(烯键)而合成相应的ω-3PUFAs。近年来，各国的科学家克隆了多个ω-3脂肪酸去饱和酶基因，但其中大部分基因只能合成18碳的ω-3PUFAs，开发利用价值不大。虽然也有报道能够合成更长链的ω-3PUFAs基因，如真菌Saprolegnia diclina的ω-3脂肪酸去饱和酶能够合成20碳的ω-3PUFAs，另一种真菌Mortierella alpina的1S-4不但能够合成20碳的ω-3PUFAs，还能合成18碳的ω-3PUFAs。真正被用于此类研究的基因是来自于线虫C.elegans的ω-3脂肪酸去饱和酶基因(Fat1)。该基因被转入哺乳动物细胞以及小鼠中能使从18碳到22碳的ω-3PUFAs的含量增加，显示出来很大的可开发利用价值。来自于线虫C.briggasae的ω-3脂肪酸去饱和酶基因Sfat1(similar to Fat1)，可打通ω-6向ω-3多不饱和脂肪酸转化的途径，制备的随机整合Sfat1转基因克隆猪，ω-3脂肪酸的含量有大幅度提高，Sfat1转基因猪肌肉组织中20碳的EPA约占总脂肪酸含量的16％，22碳的DHA约占总脂肪酸含量的4％。转入Sfat1基因构建转基因克隆猪是制备富含ω-3多不饱和脂肪酸转基因猪的有效手段。

迄今为止猪胚胎干细胞尚未成功建系，利用诱导多能干细胞技术制备的猪诱导多能干细胞并不具有生殖系嵌合能力，制备基因修饰猪主要依赖于体细胞基因修饰和体细胞核移植技术。目前，体细胞的基因修饰主要有宿主基因定点整合和外源基因随机插入两种方法。利用常规载体、转座子载体或病毒载体将目的基因整合到宿主基因组中，其整合过程属随机过程，目的基因整合在宿主基因组中的位置与拷贝数不可控。利用随机转基因主要存在以下问题：(1)外源基因整合宿主基因组位置不可控，有可能对宿主基因造成破坏，尤其是使用转座子载体和病毒载体时其更偏向于整合到宿主转录活性区；(2)外源基因在宿主基因组中的拷贝数不确定，所获得的基因修饰动物在传代过程中基因型不一致；(3)外源基因的随机整合导致其在宿主各个组织以及个体之间表达差异及个体表型不一；(4)外源基因的随机插入，尤其是利用病毒载体时其外源基因启动子容易被甲基化，造成外源基因沉默。这些缺点严重制约了基因修饰猪的培育与应用。