[发明专利]一种重组人粒细胞集落刺激因子的复性及纯化方法

说明书

本发明提供了一种重组人粒细胞集落刺激因子的复性及纯化方法，包括：1）制备包涵体溶解液；2）将包涵体溶解液加入到复性缓冲液中，加入胱氨酸和半胱氨酸，进行复性；3）上样至复合配基的弱阳离子层析柱进行纯化。本发明纯化工艺操作简便、用时短，同时设备要求不高，节约成本，适合放大的生产规模，并且复性时包涵蛋白体浓度高、复性率高、层析纯化后蛋白纯度高。

技术领域

本发明涉及生物医药及生物工程下游蛋白纯化领域，具体涉及一种重组人粒细胞集落刺激因子(recombinant human granulocyte colony stimulating factor，rhG-CSF)的复性及纯化方法。

背景技术

人粒细胞集落刺激因子(human granulocyte colony stimulating factor，hG-CSF)是一种在哺乳动物中调节粒细胞(尤其是中性粒细胞)成熟与生长的造血生长因子。它通过刺激粒细胞巨噬细胞集落形成单位(CFU-GM)向粒细胞集落形成单位(CFU-G)的分化和成熟，促进成熟中性粒细胞向外周血的释放，从而促进中性粒细胞的生长。在临床上用来治疗各种原因引起的中性粒细胞减少症，有很大的经济和社会意义。

1985年Welte.K成功的从人膀胱癌细胞株5637的培养上清液中纯化并精制出人粒细胞集落刺激因子(hG-CSF)，然后Welte.K与美国的AMGEN公司的Souza.L.M又进一步确定这种hG-CSF的N端氨基酸排列顺序，并将来源于5637细胞株的hG-CSF基因克隆化，采用基因工程技术将该基因插入大肠杆菌得到hG-CSF，开发出了重组人粒细胞集落刺激因子(rhG-CSF)，商品名为Filgratin(惠尔血)。

由于hG-CSF的来源非常有限，因此大规模工业化生产均采用基因工程的方法获得。目前国内外制药企业大多采用应用广泛的大肠杆菌系统来表达rhG-CSF。由于大肠杆菌细胞内的还原环境不利于二硫键的形成，rhG-CSF折叠错误，容易聚集，基本以无生物活性的包涵体形式存在于细胞中，需要经过变性和复性才能获得有活性的rhG-CSF。由于复性后的样品中存在大量的宿主细胞蛋白及其他相关杂质，因此，复性后的蛋白纯化至关重要。

目前，专利技术对rhG-CSF的复性方法报道很多，但都不能保证纯化工艺操作简便、时间短的同时，复性率高、复性时包涵蛋白体浓度高、纯度高。

CN1718739A报道了采用SP Sepharose High Performance(SP HP)直接对rhG-CSF复性液纯化的方法，但包涵体复性液中除了目的蛋白外，还含有一定量的宿主蛋白、脂类和脱氧核糖核酸(DNA)。SP HP填料的粒径很小，不适合用于含有较多杂质、情况复杂的复性液，而且流速慢，工艺操作时间长。

CN107188952A报道了粗包涵体经变性溶解再经过超滤等置换步骤后进行复性，最后进行Capto MMC层析纯化。但该方法实施需要置换步骤，操作复杂、时间长，且复性时包涵蛋白体浓度低、复性率低。

针对上述存在的问题，开发一种rhG-CSF复性操作简便、时间短，并且复性时包涵蛋白体浓度高、纯度高、复性率高的复性纯化工艺是十分必要的。

发明内容

本发明的目的是为了解决以上现有技术的不足而提供一种重组人粒细胞集落刺激因子的复性及纯化方法。

本发明的技术方案为：一种重组人粒细胞集落刺激因子的复性及纯化方法，包括：

1)将重组人粒细胞集落刺激因子包涵体用裂解液溶解，加入DTT，得到包涵体溶解液；

2)将包涵体溶解液加入到复性缓冲液中，加入胱氨酸和半胱氨酸，进行复性，得到重组人粒细胞集落刺激因子复性液；

3)将重组人粒细胞集落刺激因子复性液上样至复合配基的弱阳离子层析柱进行纯化。