[发明专利]原代小胶质细胞/损伤神经元共培养体系及其构建方法和应用

说明书

本发明公开了原代小胶质细胞/损伤神经元共培养体系及其构建方法和应用，所述体系包括原代小胶质细胞和损伤神经元，其中，损伤神经元被原代小胶质细胞吞噬于胞内；所述体系为体外共培养体系。本发明所述原代小胶质细胞/损伤神经元共培养体系较传统方法培养的静息小胶质细胞的不足，模拟神经损伤的微环境以激活小胶质细胞，保留了小胶质细胞的吞噬功能；本发明所述体系中的小胶质细胞能够被损伤神经元激活为巨噬细胞，增强其吞噬神经元碎片的能力；本发明所述方法构建的体系中原代细胞数量可观、性状稳定、活性较高，能够为后续的神经损伤或退变性疾病的基础研究提供可靠的共培养体系。

技术领域

本发明属于细胞生物学领域，涉及一种共培养体系，具体为原代小胶质细胞/损伤神经元共培养体系及其构建方法和应用。

背景技术

脊髓损伤是严重影响身心健康的高致残性疾病，其治疗和康复的费用高、难度极大，给个人、家庭及社会均带来了沉重的负担，故一直为医学界研究的难点与热点。小胶质细胞是中枢神经系统(CNS)中巨噬细胞源性免疫调节细胞，脊髓损伤等神经病理性改变发生后，小胶质细胞迅速激活，调控免疫应答，清理细胞碎片，对损伤后CNS的微环境的调节具有重要意义。如何研究小胶质细胞在CNS微环境中的作用是进一步研究药物综合调控的关键。

由于小胶质细胞占CNS细胞总量较少，故对于提取、纯化原代小胶质细胞存在一定难度。随着技术的发展及改革，提纯小胶质细胞的方法已经从传统的振荡、温和酶消化法等转向流式、磁珠分选等，只要条件许可，便能较为容易的分离到纯度较高的小胶质细胞。然而即使提纯到纯度较高的原代小胶质细胞，实验中亦常常面临着另一个重大问题，即该细胞纯化后增殖能力显著减弱，培养时细胞不断老化，数量不断减少，最终导致体外培养的失败。故而如何提纯、成功培养原代小胶质细胞，利于原代细胞进行实验，以获得更可靠的实验结果，依旧是科研中存在的难点之一。

目前研究CNS中小胶质细胞的吞噬作用的方法国内外文献报道主要为体内研究，或单一小胶质细胞或细胞系对墨水或荧光微球等吞噬的体外研究，而未见体外原代小胶质细胞对损伤神经元的吞噬作用。这不仅不利于模拟脊髓损伤后的微环境，而且常导致提取的原代小胶质细胞不能很好地发挥吞噬作用，促进神经再生效果较差。

因此，构建一种小胶质细胞/损伤神经元共培养体系，高效地激活小胶质细胞的吞噬作用，为进一步探索药物促进小胶质细胞吞噬作用及多靶点改善微环境显得尤为重要。

发明内容

解决的技术问题：为了克服现有技术的缺陷，获得一种能够高效激活小胶质细胞的吞噬作用，保证分离获得的细胞具有良好的细胞活性和分化能力，本发明提供了原代小胶质细胞/损伤神经元共培养体系及其构建方法和应用。

技术方案：原代小胶质细胞/损伤神经元共培养体系，所述体系包括原代小胶质细胞和损伤神经元，其中，损伤神经元被原代小胶质细胞吞噬于胞内；所述体系为体外共培养体系。

所述的原代小胶质细胞/损伤神经元共培养体系的构建方法，包括以下步骤：

第1步、小胶质细胞分离

a、无菌条件下分离新生一周内的SD大鼠脑皮质剪碎，胰酶消化15min；

b、终止消化，加入完全培养基缓慢吹打，静置后吸取上清；2000r/min×2min离心1次，弃上清，完全培养基重悬接种；4h及24h后更换培养基，之后每2-3天更换一次培养基；

c、取步骤b培养15d后的细胞，吸取原培养基并保留，润洗后加入DMEM/F12稀释的胰酶孵育25-40分钟，终止消化，胰酶浓度为0.05％～0.0625％；

d、小心吸去未贴壁细胞或细胞碎片，加入混合培养基继续培养；

第2步、原代神经元分离、培养、构建神经元损伤模型

e、无菌条件下分离18d胎鼠海马体剪碎，培养箱中胰酶消化15min，血清终止消化；