[发明专利]一种基于金纳米簇的荧光猝灭与恢复检测端粒酶的方法

权利要求书

1.一种基于金纳米簇的荧光猝灭与恢复检测端粒酶的方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)金纳米簇的制备：将HAuCl₄溶液加入到BSA溶液中，搅拌5-10min，将NaOH的水溶液加入上述混合液中，调节pH为11-12，持续搅拌；将得到的产物冷却至室温，装进透析袋中，透析过夜，过葡萄糖凝胶柱得到AuNCs@BSA，备用；

(2)Cu²⁺的猝灭：将步骤(1)中反应制得的AuNCs@BSA用水稀释，向AuNCs@BSA中加入Cu²⁺溶液，加入Tris-HCl缓冲溶液，室温反应，得到被Cu²⁺猝灭后的AuNCs@BSA，使用荧光分光光度计检测AuNCs@BSA的荧光强度；

(3)PPi的恢复：将PPi逐级稀释成不同浓度，加入被Cu²⁺猝灭后的AuNCs@BSA溶液中，加入Tris-HCl缓冲溶液，混合均匀后，室温反应8-12min后，进行荧光强度检测。

2.根据权利要求1所述一种基于金纳米簇的荧光猝灭与恢复检测端粒酶的方法，其特征在于：步骤(1)中所述HAuCl₄溶液的浓度为10mM；所述BSA溶液的浓度为50mg·mL^-1；所述HAuCl₄溶液与BSA溶液的体积比为1:1。

3.根据权利要求1所述一种基于金纳米簇的荧光猝灭与恢复检测端粒酶的方法，其特征在于：步骤(1)中所述持续搅拌的时间为21-26h，持续搅拌温度为36-38℃。

4.根据权利要求1所述一种基于金纳米簇的荧光猝灭与恢复检测端粒酶的方法，其特征在于：步骤(2)中所述Cu²⁺溶液的浓度为0-20μM；所述AuNCs@BSA溶液、Cu²⁺溶液与Tris-HCl缓冲溶液的体积比为1:1:2。

5.根据权利要求1所述一种基于金纳米簇的荧光猝灭与恢复检测端粒酶的方法，其特征在于：步骤(3)中稀释后的所述PPi的浓度为0-20μM；猝灭AuNCs@BSA溶液的所述Cu²⁺的浓度为20μM；稀释后的所述PPi、被Cu²⁺猝灭后的AuNCs@BSA溶液与Tris-HCl缓冲溶液的体积比为1:2:1。

6.根据权利要求1所述一种基于金纳米簇的荧光猝灭与恢复检测端粒酶的方法，用于检测细胞中端粒酶，其特征在于：包括以下步骤：

(1)细胞中端粒酶的提取：(a)用细胞计数器对海拉细胞进行计数，收集1×10⁶个细胞，将收集到的细胞置于离心机中，3000rpm/min制冷离心5分钟，移去上清液，得到细胞溶液；(b)将细胞溶液稀释成不同个数的细胞溶液用PBS缓冲溶液洗涤三次，离心，去除上清液，依次加入裂解液A、裂解液B和裂解液C，轻轻震荡摇匀，使细胞裂解液和细胞溶液混合，得到混合液A；(c)将步骤(b)中的细胞混合液倒入离心管中，将离心管置于冰块上，避光反应，每隔5分钟剧烈摇晃一次，直至离心管中没有悬浮颗粒出现；(d)将没有悬浮颗粒出现的离心管放入离心机中，离心，取出上层清液，将上层清液加入到盛有甘油的离心管中，得到端粒酶提取液，冷藏备用；

(2)细胞中端粒酶的检测：采用权利要求1-6中的方法检测端粒酶；

(3)细胞中端粒酶的成像：将步骤(1)中的端粒酶提取液接种在培养皿中过夜，AuNCs@BSA溶液和Cu²⁺反应生成AuNCs@BSA-Cu²⁺溶液，将AuNCs@BSA-Cu²⁺溶液分散在端粒酶提取液中，将培养皿中的端粒酶提取液在共聚焦显微镜下观察端粒酶成像效果。

7.根据权利要求6所述一种基于金纳米簇的荧光猝灭与恢复检测端粒酶的方法，其特征在于：步骤(b)中所述裂解液A：裂解液B：裂解液C的体积比为10⁶：1:5。