[发明专利]一种用微生物蛋白酶酶解制备东海乌参胶原蛋白抗氧化肽方法

说明书

一种用微生物蛋白酶酶解制备东海乌参胶原蛋白抗氧化肽方法，它是选用东海乌参作为原料，通过酸、碱和EDTA的浸泡，去除重金属和杂蛋白，获得胶原蛋白；在超声波辅助下，采用胶原蛋白酶酶解，获得胶原蛋白酶液，所述的胶原蛋白酶液中加入葡萄糖或蔗糖，调节pH=6—7，得到初始发酵液；在初始发酵液中加入就地堆肥地芽孢杆菌或地衣芽孢杆菌或巨大芽孢杆菌，密封发酵后获得发酵滤液；所述的发酵滤液经冷冻干燥或通过管式膜脱除大分子、并通过截留分级、浓缩脱盐、喷雾干燥得到东海乌参胶原蛋白肽；所述的胶原蛋白肽通过膜分离、凝胶过滤、反相高效液相色谱技术分离纯化并筛选后获得所述的胶原蛋白抗菌肽产品。

技术领域

本发明涉及的是一种用微波辅助微生物蛋白酶酶解制备东海乌参胶原蛋白抗氧化肽方法，属于蛋白抗氧化肽生物制品制备技术领域。

背景技术

东海乌参（学名：白肛海地瓜Acaudina leucoprocta），盛产于东海海区，其体壁中含有丰富的胶原蛋白，具有极高的营养价值与药用价值。然而，由于其分子量很大，不利于肠胃和皮肤的吸收。

与胶原蛋白相比，胶原蛋白肽不仅有胶原蛋白的营养特性，而且还具有抗氧化、抗菌和抗肿瘤等生物活性。东海乌参胶原蛋白，其结构稳定，肌纤维丝排列紧密，一般蛋白酶对其水解效果较差。

乌参蛋白复杂的结构使蛋白质分子内部的某些基团，不能与酶活性部位接触，难以反应。根据东海乌参结构的特点，微波处理后，由于其暴露到蛋白质分子的表面上，从而变得可以反应了。因此，微波处理之后蛋白质的水解率可以得到提高。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术存在的不足，而提供一种原料来源广，成本低，制备工艺简单，可靠性好，收率高的用微生物蛋白酶酶解制备东海乌参胶原蛋白抗氧化肽方法。

本发明的目的是通过如下技术方案来完成的，一种用微生物蛋白酶酶解制备东海乌参胶原蛋白抗氧化肽方法，它是选用东海乌参作为原料，通过酸、碱和EDTA的浸泡，去除重金属和杂蛋白，获得胶原蛋白；在超声波辅助下，采用胶原蛋白酶酶解，获得胶原蛋白酶液，所述的胶原蛋白酶液中加入葡萄糖或蔗糖，调节pH=6—7，得到初始发酵液；在初始发酵液中加入就地堆肥地芽孢杆菌或地衣芽孢杆菌或巨大芽孢杆菌，密封发酵后获得发酵滤液；所述的发酵滤液经冷冻干燥或通过管式膜脱除大分子、并通过截留分级、浓缩脱盐、喷雾干燥得到东海乌参胶原蛋白肽；所述的胶原蛋白肽通过膜分离、凝胶过滤、反相高效液相色谱技术分离纯化并筛选后获得所述的胶原蛋白抗菌肽产品。

作为优选：所述的膜分离为超滤：将胶原蛋白肽加入超滤系统，用超滤膜进行超滤；

所述的凝胶过滤采用G-25凝胶分离，超滤后的胶原蛋白肽用蒸馏水进行溶解，离心，取上清液，过0.45μm微孔滤膜，取胶原蛋白肽溶液1.5ml过Sephadex G-25柱(90 cm ×115cm(ID))，用蒸馏水为洗脱液，平衡和洗脱；

所述的反相高效液相色谱( RT- HPLC)技术分离纯化是在如下色谱条件进行:

1) 胶原蛋白肽的前处理:将胶原蛋白肽用0.06%TFA的水溶解到0.6ml，离心（12000-14000 RPM，离心10分钟）取上清；

2）系统: Agilent 1260 HPLC；

3）柱子: Zorbax SB-C18 4.6 X 250 5 um；

4）进样体积:80-10ul；

5）缓冲液和平衡缓冲液: 0.06%TFA洗脱缓冲液: 0.05%TFA的乙腈；

6）梯度: 0%–0 % B洗脱4分钟，0%–8% B洗脱25分钟，8% -100%B洗脱1分钟，100% -100%B洗脱5分钟；

7）流速: 1.0 ml/min；