[发明专利]缀合的聚合物颗粒及其制备方法

说明书

本发明涉及缀合的聚合物颗粒及其制备方法。使寡核苷酸与聚合物缀合的方法包括：用双NHS酯或二琥珀酰亚胺基碳酸酯处理包含胺官能团的聚合物，以形成官能化的聚合物；和用胺封端的寡核苷酸处理所述官能化的聚合物，以形成包括所述寡核苷酸的缀合的聚合物。寡核苷酸涂覆的颗粒用于核酸分离或核酸测序反应中。

本申请是国际申请日为2013年2月8日、申请号为201380013658.X、发明名称为“缀合的聚合物颗粒及其制备方法”的发明专利申请的分案申请。

本专利申请要求于2012年2月9日提交的美国临时申请号61/597,064的利益，所述美国临时申请以引用的方式全文并入本文。

技术领域

本公开内容总地涉及使底物缀合的方法和通过此类方法形成的底物。

背景技术

多核苷酸与底物的缀合已变成多种工业的关注点。包括缀合的多核苷酸的底物可用于分离技术、遗传标记物检测和测序中。

例如，与多核苷酸探针缀合的底物可用于捕获遗传标记物以便检测。示例性遗传标记物可与基因内的疾病变体、引起疾病的细菌或病毒、或可用于人体鉴定的等位基因有关。包括与遗传标记物互补的缀合探针的底物可捕获此类遗传标记物，且多种技术可用于检测捕获的遗传标记物的存在。

在另一个例子中，与多核苷酸缀合的底物可用于捕获并分离遗传材料。在一个例子中，在底物上的探针可与所需多核苷酸互补。探针可构造为捕获所需多核苷酸且之后释放多核苷酸，以允许多核苷酸的回收。在另一个例子中，与多核苷酸探针缀合的聚合物颗粒可用于从溶液中捕获并分离靶多核苷酸，所述多核苷酸探针与靶多核苷酸互补。随后，靶多核苷酸可在不同溶液中从缀合颗粒中释放。

在进一步例子中，与多核苷酸缀合的底物可用于多种测序技术中。例如，与多核苷酸或多核苷酸的多个拷贝缀合的聚合物颗粒可用于测序技术，例如基于荧光的测序技术或基于离子的测序技术中。

虽然缀合底物的上述用途各自对于多种工业是特别有利的，但多核苷酸与底物例如聚合物底物的可靠缀合通常是低效的。此类低效导致较低密度的缀合的多核苷酸或缺乏所需多核苷酸的随机区域。此类低效可导致弱分离、检测方法中的低精确度、以及测序技术中的低信号或高信噪比。

因此，改良的缀合方法将是希望的。

发明内容

在第一个方面，使底物缀合的方法包括使与生物分子结合的抗衡离子与亲脂抗衡离子交换，以形成生物分子复合物，将生物分子复合物分散在非水性溶剂中，并且在非水性溶剂的存在下使生物分子复合物与底物偶联。

在第二个方面，使聚合物颗粒缀合的方法包括使与多核苷酸结合的阳离子抗衡离子与亲脂阳离子抗衡离子交换，以形成多核苷酸复合物，该多核苷酸包括亲核或亲电反应基团。该方法还包括将多核苷酸复合物分散在非反应性、非水性溶剂中，并且通过亲核或亲电取代使多核苷酸与聚合物颗粒偶联，该聚合物颗粒包括亲电基团或亲核基团。

在第三个方面，聚合物颗粒包括使用上述方面或例子中的任一种的方法与多核苷酸缀合的聚合物。

在第四个方面，测序方法包括在寡核苷酸缀合的聚合物颗粒的存在下，扩增靶多核苷酸以形成多核苷酸缀合的聚合物颗粒。寡核苷酸至少部分与靶多核苷酸互补。寡核苷酸缀合的聚合物颗粒通过上述方面或例子中的任一种的方法形成。该方法还包括将多核苷酸缀合的聚合物颗粒应用于测序装置，将引物应用于多核苷酸缀合的聚合物颗粒，掺入核苷酸并检测掺入。

在第五个方面，分离靶多核苷酸的方法包括使含有靶多核苷酸的第一溶液与探针缀合的底物接触。探针缀合的底物的探针至少部分与靶多核苷酸互补。探针缀合的底物通过上述方面或例子中的任一种的方法形成。该方法还包括在靶多核苷酸与探针偶联的同时洗涤探针缀合的底物，并且在第二溶液中释放靶多核苷酸。