[发明专利]一种提高芽孢杆菌抗菌脂肽产量的发酵方法

权利要求书

1.一种提高芽孢杆菌抗菌脂肽产量的发酵方法，其特征在于包括以下步骤：

1)利用芽孢杆菌(Bacillus sp.)Pc3在LB液体培养基发酵，在发酵过程中添加脂肪酸；所述芽孢杆菌(Bacillus sp.)Pc3分离自南极海水，已于2013年10月13日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCCNO：M2013470；所述LB液体培养基的配方为：酵母粉1％，蛋白胨0.5％，氯化钠1％，pH为7.0～7.2；所述脂肪酸为十七烷酸，所述脂肪酸的质量与体积浓度为0.01g/L；所述添加的时间为起始发酵36min；

2)将抗菌脂肽分离，所述分离的方法为：发酵液离心，除去菌体，收集发酵上清；用盐酸调节发酵上清pH值至2.0进行酸沉淀，4℃过夜后再离心，收集沉淀；沉淀物冷冻干燥后利用甲醇浸提，对甲醇浸提物减压浓缩获得脂肽粗提物；然后对脂肽粗提物分离，收集色谱峰，再分离活性峰，收集色谱峰，进行质谱鉴定；

3)经质谱鉴定。

2.如权利要求1所述一种提高芽孢杆菌抗菌脂肽产量的发酵方法，其特征在于在步骤1)中，所述发酵的条件为：发酵温度为28℃，摇床转速为180r/min，发酵时间为96min。

3.如权利要求1所述一种提高芽孢杆菌抗菌脂肽产量的发酵方法，其特征在于在步骤2)中，所述发酵液离心是在室温条件下，发酵液8500r/min离心10min；所述4℃过夜后再离心采用9500r/min离心15min；所述浸提是浸提3次。

4.如权利要求1所述一种提高芽孢杆菌抗菌脂肽产量的发酵方法，其特征在于在步骤2)中，所述对脂肽粗提物分离利用GEprime plus蛋白分离纯化系统：HiprepTM 16/60Sephacryl TM S-100HR预装柱对脂肽粗提物分离。

5.如权利要求1所述一种提高芽孢杆菌抗菌脂肽产量的发酵方法，其特征在于在步骤2)中，所述再分离活性峰，收集色谱峰，利用反相高压液相色谱进一步分离活性峰，高效液相色谱法条件如下：仪器：安捷伦1260HPLC，InertSustainC18 column，5μm,4.6×250mm，流动相包括A液和B液，所述A液为0.1％三氟乙酸水溶液，所述B液为0.1％三氟乙酸甲醇溶液，洗脱程序：0～3min，70％B～75％B；3～8min，75％B～85％B；8～30min，85％B～95％B；30～40min，95％B；流速：0.8mL/min，检测波长：220nm；所述质谱鉴定利用MALDI-TOF-MS进行质谱鉴定。

6.如权利要求1所述一种提高芽孢杆菌抗菌脂肽产量的发酵方法，其特征在于在步骤3)中，所述质谱鉴定的结果为：抗菌脂肽包含4种脂肪酸链长为C14～17的伊枯草菌素A的同系物、4种脂肪酸链长为C14～C17的芬荠菌素B的同系物和3种脂肪酸链长为C14～16的表面活性菌素的同系物。