[发明专利]一种植物RNAi表达载体及其构建方法和应用

说明书

本发明属于基因工程技术领域，具体涉及一种植物RNAi表达载体及其构建方法和应用。本发明以商业化的植物表达载体pCambia2301和pHANNIBIAL为基础，构建了含有CaMV35S启动子、内含子、OCS终止子、两个方向相反的Gateway盒子的植物RNAi表达载体，该载体可利用Gateway技术进行植物目的基因沉默载体的构建；本发明还建立了所述植物RNAi表达载体的构建方法，以及利用融合PCR进行一步Gateway反应构建含有目的基因RNAi沉默载体的应用。

技术领域

本发明属于基因工程技术领域，具体涉及一种植物RNAi表达载体及其构建方法和应用。

背景技术

植物突变体很难获得，有些基因的突变对植物可能是致死的，基因沉默相对容易获得，RNA干扰(RNA interference,RNAi)是一种转录后基因沉默技术，是一种有效的研究功能基因的反向遗传学工具。RNAi是由双链RNA(dsRNA)介导的由特定酶参与的转录后基因沉默现象，该现象是Andrew Fire和Craig Mello等首先在线虫中发现的，是一种在真核生物中非常保守且普遍存在的机制，它是通过将与靶基因的转录产物mRNA存在同源互补序列的具有部分双链结构的RNA(dsRNA)导入细胞后，然后将与之同源的mRNA高效特异的降解成21～23nt的小片段，促使细胞内特定基因缺失，最后达到阻止基因表达的目的。RNAi基因沉默实验中，双链RNA往往以发夹结构RNA的形式存在。

传统构建植物RNAi表达载体，常规采用的方法是酶切和连接，对目的基因片段进行切割并且回收，受制于限制性内切酶的切点，既浪费时间过程又繁琐，并且小片段很难回收，多个片段不容易连接，质粒载体的分子量都比较大，用酶切和连接的方法构建载体成功率不高。

Gateway技术是Invitrogen已经商业化的技术，它是基于噬菌体的位点特异性重组反应，在目的片段添加重组位点，将PCR产物与含重组位点的供体载体混合进行BP反应获得入门载体(Entry clone)，入门载体可以和不同用途的目标载体进行LR反应获得相应的表达载体，也就是说利用该技术获得表达载体通常需要通过BP反应和LR反应两个步骤，实验周期较长，成本较高。

发明内容

本发明目的在于克服现有技术的不足，提供一种植物RNAi表达载体及其构建方法和应用。

为实现上述目的，本发明采用以下技术方案：

本发明提供一种植物RNAi表达载体，所述植物RNAi表达载体含有目的基因片段表达元件，所述目的基因片段表达元件含有CaMV35S启动子、内含子、OCS终止子、两个方向相反的Gateway盒子；所述内含子位于两个方向相反的Gateway盒子之间，用于表达发卡RNA结构中的环；所述Gateway盒子含有attR1位点、attR2位点、CmR基因、ccdB基因和一个EcoRI酶切位点，Gateway盒子用于表达方向相反的目的基因片段，构成发卡RNA结构中的臂。

进一步地，所述Gateway盒子是EcoRⅤ酶切pBS-Gateway-rfA载体获得，所述EcoRⅠ酶切位点距离attR1位点453bp，距离attR2位点1257bp。

进一步地，所述目的基因片段表达元件以pHANNIBAL载体为中间载体获得；所述植物RNAi表达载体以pCambia2301载体为骨架，将目的基因片段表达元件插入pCambia2301载体的多克隆位点中获得。

进一步地，所述植物RNAi表达载体的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

本发明还提供了上述植物RNAi表达载体的构建方法，包括以下步骤：