[发明专利]一种立克次氏体巢式PCR特异性引物及检测试剂盒与巢式PCR检测方法

说明书

一种立克次氏体巢式PCR特异性引物及检测试剂盒与巢式PCR检测方法，本方法的模板DNA制备步骤简单费用低，本方法检测非常方便快捷，并能提高检测方法的特异性及敏感性，单蜱虫甚至蜱虫的部分组织器官提取的微量基因组DNA即可作为模板进行鉴定，针对立克次氏体的pCS20为靶基因的特异性区域，设计4条特异性引物，解决了现有PCR检测技术低特异性和低敏感性，扩增时容易产生假阳性、蜱虫体内立克次氏体含量较低时容易漏检的缺陷，本发明方法反应特异性更强、敏感性更高，该方法专用于立克次氏体精准检测，应用前景广阔。

技术领域

本发明具体涉及生物学技术领域，具体涉及一种立克次氏体巢式PCR特异性引物及检测试剂盒与巢式PCR检测方法。

背景技术

立克次氏体是一类依赖于宿主细胞和专性细胞内寄生的小型革兰氏阴性原核单细胞微生物，介于细菌和病毒之间，较接近于细菌。由立克次氏体引起的疾病统称立克次氏体病，是一种人畜共患的自然疫源性疾病，人被感染立克次氏体的媒介昆虫叮咬或接触其粪便可被感染。该病在历史上曾经严重威胁人类健康，造成灾难，目前已成为世界性关注的疾病。人类立克次氏体病的传染源主要是感染的家畜，特别是牛和羊。在动物之间，该病原体以蜱为传播媒介进行传播并可以经卵传代，从而形成自然疫源地。动物感染立克次氏体后多呈亚临床经过，但绵羊和山羊有时出现食欲不振，体质量下降，产奶量减少和流产、死胎等现象；牛可出现不育和散在性流产。立克次氏体的临床诊断主要的方法是直接镜检、血清学诊断(酶联免疫吸附实验和间接免疫荧光试验)、常规PCR检测及病原分离等。直接镜检只能用于对发病动物的检测，但对疫病普查和进出口检疫则有困难。血清学诊断主要是间接免疫荧光分析，但是此方法敏感性不高。敏感性更高的方法，例如常规PCR检测技术也是诊断寄生在蜱体内的立克次氏体最常用的方法，但是该方法具有很大的一个缺点一低特异性和低敏感性，扩增时容易产生假阳性、蜱虫体内立克次氏体含量较低时容易漏检。巢式PCR使用两套引物通过两轮PCR反应扩增靶基因DNA片段，第一对PCR引物扩增片段和普通PCR相似，第二对引物结合在第一次PCR产物内部，反应特异性强、敏感性高。巢式PCR检测技术已广泛应用于病原体检测。

发明内容

为了解决现有技术的缺陷及不足本发明提供了了一种立克次氏体巢式PCR特异性引物及检测试剂盒与巢式PCR检测方法，建立一种精准、高效、实用的DNA检测方法。针对立克次氏体的pCS20为靶基因的特异性区域，设计4条特异性引物，提供了一种立克次氏体的巢式PCR特异性引物及检测试剂盒与巢式PCR检测方法，可用于立克次氏体病精准检测，应用前景广阔，该方法可用于双芽巴贝斯虫病流行病学调查及快速检测。

本发明采用的技术解决方案是：一种立克次氏体巢式PCR特异性引物，包括设计的两对特异性引物，具体为：

外引物EF1∶5′-TTT-CCC-TAT-GAT-ACA-GAA-GGT-AAC-3′；

内引物ER1：5′-AAA-GCA-AGG-ATT-GTG-ATC-TGG-ACC-3′；

外引物EF2：5′-ACT-AGT-AGA-AAT-TGC-ACA-ATC-TAT-3′；

内引物ER2：5′-TGA-TAA-CTT-GGT-GCG-GGA-AAT-CCT-T-3″。

一种立克次氏体巢式PCR检测试剂盒，所述的巢式PCR检测试剂盒包括以下组分：

(一)权利要求1所述的两对特异性引物；

(二)阳性对照：所述的阳性对照为含有目的基因片段的重组质粒，该质粒含立克次氏体993bp基因片段；

(三)阴性对照：所述的阴性对照为去离子水；

(四)Taq酶。

所述的阳性对照通过将扩增产物克隆至pUCm-T转化DH5-α感受态细胞，经酶切鉴定及测序后获得为阳性重组质粒的阳性对照。