[发明专利]一种双芽巴贝斯虫巢式PCR特异性引物及检测试剂盒与巢式PCR检测方法

权利要求书

1.一种双芽巴贝斯虫巢式PCR特异性引物，其特征在于，包括设计的两对特异性引物，具体为：

外引物BF1：5＇-CAT-CTA-ATT-TCT-CTC-CAT-ACC-CCT-CC-3′；

内引物BR1：5＇-CCT-CGG-CTT-CAA-CTC-TGA-TGG-CAA-AG-3′；

外引物BF2：5′-CGC-AAG-CCC-AGC-AGG-CCC-CGG-TGC-3′；

内引物BR2：5′-CCG-ACC-TGG-ATA-GGC-TGT-GTC-ATG-3′。

2.一种双芽巴贝斯虫巢式PCR检测试剂盒，其特征在于，所述的巢式PCR检测试剂盒包括以下组分：

(一)权利要求1所述的两对特异性引物；

(二)阳性对照：所述的阳性对照为含有目的基因片段的重组质粒，该质粒含双芽巴贝斯虫405bp基因片段；

(三)阴性对照：所述的阴性对照为去离子水；

(四)Taq酶。

3.根据权利要求2所述的双芽巴贝斯虫巢式PCR检测试剂盒，其特征在于，所述的阳性对照通过将扩增产物克隆至pUCm-T转化DH5-α感受态细胞，经酶切鉴定及测序后获得为阳性重组质粒的阳性对照。

4.一种采用权利要求1所述的特异性引物的双芽巴贝斯虫巢式PCR检测方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)被检标本DNA提取：取微小牛蜱和扇头蜱数只，酒精清洗，每只蜱放入单独的1.5mlEP dof管，200μL PBS液浸没小牛蜱和扇头蜱，用样品破碎仪破碎蜱的虫体，吸取破碎后的溶液，加入Trizol试剂裂解，采用常规的酚/氯仿抽提，乙醇沉淀，干燥后用三羟甲基氨基甲烷-乙二胺四乙酸溶解，-20℃保存备用；

(2)以权利要求1中的外引物BF1、BR1扩增：在EP dof管中加入处理后的蜱标本DNA，同时设阴、阳性对照，10×PCR Buffer，Mgcl2，dNTP，Taq酶，25pmol/μL BF1，25pmol/μL BR1，DNA模板，ddH2O混匀后稍离心的50μL反应体系中进行第一轮PCR；

(3)以权利要求1中的内引物BF2、BR2扩增：以第一轮PCR产物DNA为模板，以BF2、BR2为第二套引物，在10×PCR Buffer 5μL，Mgcl2 2μL，dNTP 4μL，Taq酶0.5μL，25pmol/μL BF2 1μL，25pmol/μL BR2 1μL，DNA模板2μL，ddH2O 34.5μL混匀后稍离心的50μL反应体系进行第二轮PCR；

(4)PCR产物鉴定：取第二轮PCR产物2μL进行1.5％琼脂糖凝胶电泳鉴定；

(5)测序：将第二轮PCR产物送测序公司进行序列测定。

5.根据权利要求4所述的双芽巴贝斯虫巢式PCR检测方法，其特征在于，所述的步骤(2)中的第一轮PCR反应条件为：

95℃预热5min；

95℃保持30s，56℃保持1min，72℃保持1min，该步骤进行共30个循环；

末次延伸至72℃，保持10min。

6.根据权利要求4所述的双芽巴贝斯虫巢式PCR检测方法，其特征在于，所述的步骤(2)中的第二轮PCR反应条件为：

95℃预热5min；

95℃保持30s，56℃保持1min，72℃保持1min，该步骤进行共30个循环；

末次延伸至72℃，保持10min。