[发明专利]一种全细胞转化苯丙氨酸生产苯乳酸的方法

说明书

本发明公开了一种全细胞转化苯丙氨酸生产苯乳酸的方法，属于酶工程技术领域。本发明成功实现了L‑氨基酸脱氨酶，L‑乳酸脱氢酶和甲酸脱氢酶共表达菌株的构建。全细胞转化L‑苯丙氨酸可生产30g/L苯乳酸，转化率为100％。此全细胞转化体系的建立，解决了化学法合成苯乳酸的步骤繁琐、得率低、污染环境等问题及酶法转化生产α‑酮戊二酸的转化率低的问题，实现了无污染、高产率、一步法生产苯乳酸，为后续工业化生产奠定了一定的理论基础。

技术领域

本发明涉及一种全细胞转化苯丙氨酸生产苯乳酸的方法，属于酶工程技术领域。

背景技术

苯乳酸(phenyllactic acid,PLA)，又称β-苯基乳酸、3-苯基乳酸，即2-羟基-3-苯基丙酸，是一种广泛存在于自然界中的小分子天然有机酸。苯乳酸有两种对映异构体，即L-苯乳酸和 D-苯乳酸。苯乳酸是一种天然抑菌物质，最初是在干酪中发现的，也存在于天然蜂蜜中，对多种病原性微生物具有抑制作用，革兰氏阳性菌如金黄色葡萄球菌、李斯特菌革兰氏阴性菌如大肠杆菌、沙门氏菌等，但是对人和动物细胞无毒。

相比常见的化学防腐剂，苯乳酸不仅安全无毒，而且对真菌具有广谱抑制作用，且抑菌活性强于常见的化学防腐剂；相比其他生物防腐剂，苯乳酸抑菌谱广，对革兰氏阳性菌、革兰氏阴性菌和真核微生物均有抑制作用。此外，苯乳酸溶解度高，在水中更易溶解和扩散，故能在各种食品体系中均匀扩散；稳定性强，熔点为121-125℃，对酸和热都比较稳定

目前苯乳酸合成主要有化学法和生物法两种，生物法分为酶法和发酵法。在苯乳酸生物合成过程中，苯丙氨酸通过转氨基作用生成苯丙酮酸，苯丙酮酸进一步还原为苯乳酸，此过程需要辅酶NADH的参与。

全细胞转化相比分离酶具有如下优势：全细胞生物催化剂更容易制备，成本低；比分离酶更稳定，不易受环境温度、pH等因素影响，使用方便；转化过程中不产生有毒害产品，不产生其他副产物。有望实现低能耗、高效率、高纯度、无污染的工业化苯乳酸生产。

现有技术中，已有全细胞转化苯丙酮酸生成苯乳酸的方法，为转化L-苯丙氨酸生产苯乳酸奠定了基础。然而，苯丙酮酸价格昂贵，市场价格为苯丙氨酸的600倍(L-苯丙氨酸价格为130元/kg，苯丙酮酸钠价格为80元/g)，不适合工业化生产，因此，价格便宜的苯丙氨酸更具备作为底物生产苯乳酸的工业化应用潜力。

发明内容

为实现以苯丙氨酸为底物工业化生产苯乳酸，本发明的第一个目的是提供一种以L-苯丙氨酸为底物生产苯乳酸的基因工程菌，该基因工程菌共表达L-氨基酸脱氨酶、乳酸脱氢酶和甲酸脱氢酶。

在本发明的一种实施方式中，所述基因工程菌以大肠杆菌为宿主。

在本发明的一种实施方式中，所述大肠杆菌为E.coli BL21(DE3)、E.coli JM109、E.coli DH5α或E.coli TOP10。

在本发明的一种实施方式中，所述L-氨基酸脱氨酶(L-AAD)为L-氨基酸脱氨酶突变体 (D165K/F263M/L336M)，其氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。

在本发明的一种实施方式中，所述乳酸脱氢酶的含有SEQ ID NO,2所示的氨基酸序列；所述甲酸脱氢酶含有SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列。

在本发明的一种实施方式中，所述乳酸脱氢酶来源于Lactobacillus sp.CGMCC9967，已公开于公开号为104560800A的专利申请文件中。

在本发明的一种实施方式中，所述甲酸脱氢酶来源于奇异变形杆菌(proteusmirabilis)。

在本发明的一种实施方式中，编码所述L-氨基酸脱氨酶的基因如SEQ ID NO.4所示。

在本发明的一种实施方式中，编码所述乳酸脱氢酶的基因如SEQ ID NO.5所示。