[发明专利]AnChi基因、AnChi几丁质酶及其在降解几丁质方面的应用

说明书

本发明公开一种高效几丁质酶的制备方法及应用，首先涉及一种编码几丁质酶的基因和与之对应的几丁质酶，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，其氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示，其对发酵工业废弃物黑曲霉菌丝体水解具有更高的催化活性。通过构建枯草芽孢杆菌表达系统，使得制备AnChi的成本显著下降，提高了应用范围和生产能力。

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种AnChi基因、高效几丁质酶、其表达系统及在酶法降解几丁质生产N-乙酰葡萄糖胺中的应用。

背景技术

N-乙酰葡萄糖胺(GlcNAc)是一种葡萄糖衍生物，常以β-1,4糖苷键连接成高聚物存在于多种生物的结构成分中。因其具有多种生物活性，如修复关节损伤，治疗肠胃炎以及皮肤美白等，广泛应用于食品化妆品添加剂中。

工业制备N-乙酰葡萄糖胺的方法可分为三类：化学合成，生物合成以及酶法降解几丁质。化学合成存在收率低，产物有毒性，生产过程污染环境等缺点，目前已经逐步淘汰；生物合成利用微生物代谢过程生产，其收率稳定，绿色环保，是目前最主要的生产方式。

酶法降解几丁质生产N-乙酰葡萄糖胺是利用几丁质酶作为催化剂，催化几丁质降解，是近年来出现的极具吸引力的方法，其原料来源广泛，产品收率高，生物活性好，生产过程更加环保。几丁质是一种天然高分子聚合物，广泛存在于甲壳纲动物的外壳，昆虫外骨骼以及真菌细胞壁中。生产N-乙酰葡萄糖胺所用的几丁质原料一般来自于虾蟹壳，其几丁质结晶度较高，来源具有季节性，产品适用人群受限(海鲜过敏以及宗教信仰)。另一类原料是真菌细胞壁，其几丁质含量达到15％，结晶度低，有利于酶的水解。黑曲霉(Aspergillusniger)是一种工业发酵中常用的丝状真菌，每年有近34万吨的菌丝体副产物产生，其几丁质含量可达20％。黑曲霉菌丝体是一种安全的原料，其安全性通过FDA美国食品安全性指标认证。因此，黑曲霉菌丝体是一种可靠的生产N-乙酰葡萄糖胺的原料。

酶法生产面临的一大问题是酶的生产纯化成本过高，降低获得高产能高纯度的几丁质酶的成本是工艺设计中非常重要的环节。工业生产最早使用的是通过野生菌种产生的几丁质酶，及表达量低，粗酶液中含有次级代谢产物，影响产品的质量。随着基因工程技术的发展，使用工程菌重组表达的几丁质酶逐渐替代了野生菌生产，其表达量大，效率高。目前工程菌一般有三种，大肠杆菌，酵母和枯草芽孢杆菌。大肠杆菌多为胞内或周质空间表达，对酶进行分离时需要破壁处理，过程中释放大量内毒素，既提高了生产成本，又降低了产品的安全性。酵母作为真菌表达系统，其表达效率较低。

黑曲霉菌丝体中几丁质含量较高，但其与蛋白质和葡聚糖交联成致密的结构，常用的几丁质酶难以对其进行有效的降解。作为一种廉价的工业废料，寻找更适合降解黑曲霉菌丝体的几丁质酶，实现对菌丝体的高效利用，变废为宝是值得关注的问题。

发明内容

为了解决上述问题，本发明寻找并获得了更适合降解黑曲霉菌丝体的AnChi基因、几丁质酶，能够降解工业黑曲霉菌丝体中的几丁质，可获得较高浓度的壳二糖，具有较高的收率，具有很好的工业化应用前景。

首先，本发明公开一种高效几丁质酶AnChi基因，其核苷酸序列为如SEQ ID NO.1所示。

进一步的，本发明公开了利用上述的AnChi基因编码的几丁质酶AnChi，所述几丁质酶AnChi的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。

进一步的，本发明还公开了利用上述技术方案中所述的AnChi基因在降解几丁质方面的应用。而对于基因的应用类发明，主要分为对基因的重组、表达以及生产等诸多方面。

进一步的，本发明所述的应用，是构建含有所述高效几丁质酶AnChi基因的重组质粒。