[发明专利]以消除寄主DNA污染用于水体环境病毒宏基因组解析的方法

权利要求书

1.以消除寄主DNA污染用于水体环境病毒宏基因组解析的方法，其特征在于该方法按以下步骤实现：

一、水体病毒颗粒分离浓缩：

a、采集野外水体，得到水样；

b、水样经多层尼龙纱布过滤，然后通过切向流过滤系统的滤柱去除细菌，得到病毒颗粒溶液；

c、病毒颗粒溶液经切向流过滤系统的滤柱浓缩，得到病毒颗粒浓缩液；

d、将病毒颗粒浓缩液加到超速离心管中，在超速离心管底部加入质量浓度为19％～21％的蔗糖溶液，然后进行离心处理，得到离心后的病毒颗粒浓缩液；

e、倒出超速离心管内液体后倒置在滤纸上静置，再用灭菌超纯水重悬附着在超速离心管底部管壁的病毒颗粒，得到病毒颗粒超离浓缩液；

二、病毒浓缩液寄主遗传物质消除：

f、向步骤e的病毒颗粒超离浓缩液中加入DNase和RNase工作液，在36～38℃条件下水浴处理，得到酶解的病毒颗粒浓缩液；

g、从步骤f酶解的病毒颗粒浓缩液中取出1～2μL，采用细菌通用引物27F/1492R进行PCR扩增，用于检测是否有寄主遗传物质污染；

当凝胶电泳检测没有目标条带，则表明消除寄主遗传物质污染，然后将无寄主DNA污染病毒浓缩液在78～82℃金属浴上处理，灭活浓缩液中的DNase和RNase酶活性，得到不含寄主遗传物质的病毒颗粒浓缩液；

当凝胶电泳检测有目标PCR条带，则表明存在寄主遗传物质污染，向步骤f酶解的病毒颗粒浓缩液加入溶菌酶，在36～38℃条件下水浴2.5～3.5h，然后取出1～2μL采用细菌通用引物27F/1492R进行PCR扩增，凝胶电泳检测没有目标条带，表明消除寄主遗传物质污染，然后无寄主DNA污染病毒浓缩液在78～82℃金属浴上处理，灭活浓缩液中的DNase和RNase酶活性，得到不含寄主遗传物质的病毒颗粒浓缩液；

三、病毒宏基因组提取及全基因组扩增：

h、采用试剂盒提取不含寄主遗传物质的病毒颗粒浓缩液的病毒基因组，再对获得的病毒基因组进行多重置换全基因组扩增，所得MDA病毒宏基因组样品经沉淀纯化后，进行病毒宏基因组测序分析。

2.根据权利要求1所述的以消除寄主DNA污染用于水体环境病毒宏基因组解析的方法，其特征在于步骤b中水样经多层400目尼龙纱布过滤。

3.根据权利要求1所述的以消除寄主DNA污染用于水体环境病毒宏基因组解析的方法，其特征在于步骤d中的离心处理是在4℃下以28000rpm的转速离心2h。

4.根据权利要求1所述的以消除寄主DNA污染用于水体环境病毒宏基因组解析的方法，其特征在于步骤e得到200～500μL病毒颗粒超离浓缩液。

5.根据权利要求1所述的以消除寄主DNA污染用于水体环境病毒宏基因组解析的方法，其特征在于步骤f向病毒颗粒超离浓缩液中加入浓度为10mg/mL的DNase和RNase工作液，使终浓度分别达到1μg/mL。

6.根据权利要求1所述的以消除寄主DNA污染用于水体环境病毒宏基因组解析的方法，其特征在于步骤f在37℃条件下水浴处理5～12h。

7.根据权利要求1所述的以消除寄主DNA污染用于水体环境病毒宏基因组解析的方法，其特征在于步骤g向酶解的病毒颗粒浓缩液加入浓度为50mg/mL的溶菌酶20～50μL。

8.根据权利要求1所述的以消除寄主DNA污染用于水体环境病毒宏基因组解析的方法，其特征在于对步骤g得到无寄主DNA污染病毒浓缩液进行荧光显微镜观察，即取10μL不含寄主遗传物质的病毒颗粒浓缩液加入到离心管中，加入1:400稀释的SYBR Green I核酸染料10μL，用移液枪枪头混匀，避光染色15min。