[发明专利]一种稳定表达VEGF120的间充质干细胞株及其体外应用

说明书

本发明提供了一种能稳定高表达外源VEGF的BM‑MSCs细胞株，采用慢病毒过表达系统PLVTH‑pol‑IRES‑puro共转染293T细胞后收获的慢病毒感染BM‑MSCs获得。该细胞株能修复高脂微环境下胰岛微血管内皮细胞MS‑1的增殖损伤，促进其生存能力，为糖尿病微血管病变的治疗提供了可能的思路及方法。

技术领域

本发明涉及一种稳定表达VEGF₁₂₀基因的骨髓源间充质干细胞株及其制备方法，且这种细胞株能够有效改善糖尿病病理环境下胰岛微血管内皮细胞的增殖生存能力。

背景技术

糖尿病是一种以高血糖为特征的代谢性疾病，主要是由于胰岛素分泌缺陷或其生物作用受损引起，并伴有眼、肾、足、心脏等处的慢性血管并发症。据2016年4月世界卫生组织(WHO)报告显示：全球已有超过4亿人患有糖尿病，占总人口的8.5％；近40年的时间里，成年糖尿病患者增加了3倍，且绝大部分在发展中国家；预计到2030年，糖尿病将成为第7大致死病因。而我国是全球糖尿病患者最多的国家，成年人患糖尿病及前驱糖尿病的比例也分别达到11.6％及50.1％，昂贵的医疗费用及巨大的精神压力已摧毁了无数家庭的幸福。目前尚未找到根治糖尿病的方法，患者以药物控制为主要治疗手段，分为口服药物治疗及注射胰岛素治疗，而前者副作用大，后者价格昂贵，因而寻找根治糖尿病的方法已迫在眉睫。

胰岛是高度血管化的器官，β细胞通过分泌血管生长因子(如VEGF，血管内皮生长因子)募集内皮细胞，而内皮细胞分泌活性因子(如HGF，肝细胞生长因子)维持β细胞正常生理功能，并在β细胞周围形成密集毛细血管网络，传递氧及营养物质，并及时对血糖改变做出应答进而精确调控。糖尿病病理状态下，内皮细胞受到损伤，血管基底膜增厚，窗孔结构减少，有效滤过面积降低；内皮细胞线粒体肿胀，嵴排列紊乱，基质密度降低，造成信息传递一定程度阻断，β细胞对机体血糖变化应答缓慢。

VEGF是血管内皮细胞特异性的肝素结合生长因子，有调控血管通透性，促进血管形成，促进内皮细胞增殖及迁移等多种生物学活性。在胰岛内，VEGF主要由内分泌细胞表达分泌，在维持葡萄糖稳态及糖尿病发生发展中扮演着重要的作用。研究表明，在β细胞特异性敲除VEGF-A的转基因小鼠中，血管密度下降，胰岛超微结构发生改变，葡萄糖稳态遭到破坏；在β细胞特异性过表达VEGF-A的转基因小鼠中，短期过表达后恢复基线会促进β细胞和内皮细胞的增殖生存，而长期过表达会导致内皮细胞大量增殖而抑制β细胞的活性。

间充质干细胞(Mesenchymal stem cells，MSCs)是一种来源于发育早期中胚层的多能干细胞，其多向分化潜能及在损伤部位靶向募集的能力能直接或间接地起到糖尿病治疗作用。国内外研究表明，多次尾静脉注射MSCs能缓解II型糖尿胰岛功能损伤；并且在特定诱导条件下，MSCs能分化为内皮细胞、上皮细胞修复胰岛的血管损伤；而过表达VEGF的MSCs能增强胰岛移植的效果，治疗糖尿病小鼠下肢血管损伤，促进伤口愈合。

因而，本发明旨在MSCs中稳定高表达VEGF，利用MSCs的靶向募集作用及VEGF的血管修复作用，在体外一定程度上缓解胰岛微血管内皮的损伤，为体内实验提供依据并为糖尿病研究和治疗提供一种可靠的新思路。

发明内容

本发明在于构建一种稳定过表达VEGF₁₂₀基因的骨髓源间充质干细胞株(BM-MSCs)。本发明运用PLVTH-pol-IRES-puro慢病毒过表达系统共转染293T细胞收获慢病毒，后用慢病毒感染BM-MSCs，成功获得稳定过表达VEGF₁₂₀基因的BM-MSCs细胞株。

优选地，慢病毒表达系统包括过表达载体质粒PLVTH质粒、包装质粒p8.91、包膜质粒pMD2.G，且转染时三者质量比为4∶3∶2。

优选地，将VEGF₁₂₀基因整合到PLVTH载体时选取酶切位点为Pme I和Spe I。