[发明专利]利用抗病基因识别无毒效应蛋白以鉴定具有分泌功能信号肽的方法

说明书

本发明提供了一种利用抗病基因识别无毒效应蛋白以鉴定具有分泌功能信号肽的方法，包括以下步骤：(1)将待鉴定信号肽连接致病疫霉无毒效应蛋白Avr3a的C端构建表达载体，所述致病疫霉无毒效应蛋白Avr3a的C端氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示；(2)将步骤(1)构建的表达载体转化感受态细胞；(3)将步骤(2)的感受态细胞和含有抗病基因的感受态细胞共同注射入植物细胞中，观察注射位点坏死情况，若注射位点坏死，则待检测信号肽不具有分泌功能，若注射位点无坏死，则待检测信号肽具有分泌功能。

技术领域

本发明属于植物基因工程领域，具体地说，涉及一种利用抗病基因和无毒效应蛋白在细胞内识别并引起细胞坏死的特点来鉴定具有分泌功能信号肽的方法。

背景技术

分泌蛋白指的是在细胞内合成，能够分泌到细胞外发挥作用的蛋白质。信号肽位于分泌蛋白的N端，一般由15-30个氨基酸组成。当信号肽序列合成后，被信号识别颗粒所识别，蛋白质合成暂停或减缓，信号识别颗粒将核糖体携带至内质网上，蛋白质合成重新开始。在信号肽的引导下，新合成的蛋白质进入内质网腔，最终被转移到细胞外，信号肽则被切除。

植物病原菌分泌的无毒效应蛋白进入寄主植物细胞后，能够被对应的抗病基因识别，引起植物细胞坏死。目前，植物病原细菌、真菌以及卵菌中大量的无毒效应蛋白和对应的抗病基因已经被鉴定。例如，卵菌中致病疫霉的无毒效应蛋白Avr3a和寄主中对应的马铃薯抗病基因R3a已经被鉴定，R3a在植物细胞中可以识别Avr3a，引起细胞坏死。由于R3a在植物细胞中发挥作用，对Avr3a的识别也发生在细胞内，因此Avr3a在植物细胞外时则不能被识别，从而不能引起细胞坏死。

当前，检测分泌信号肽功能的方法有酵母的pSUC2系统、分泌蛋白融合标签后在病原菌中超量表达后进行检测等。酵母系统需要进行酵母转化，并且在多种培养基上验证，操作过程繁琐，费用高。在病原菌中超量表达融合有标签蛋白的分泌蛋白，需要进行病原菌的转化，效率较低，周期长，并且费用较高。现有技术亟需一种操作简单、成本低、准确率高、效率高且耗时短的检测具有分泌功能信号肽的方法。

发明内容

本发明的目的是提供一种成本低、准确率高、成本低、耗时短的鉴定信号肽是否具有分泌功能的方法。本发明利用Avr3a和R3a在植物细胞内识别引起细胞死亡的特点，在本氏烟中表达R3a以及融合检测信号肽的Avr3a，观察其是否可以引起坏死，可以快速高效的检测信号肽是否具有分泌功能。

本发明提供了一种利用抗病基因识别无毒效应蛋白以鉴定具有分泌功能信号肽的方法，所述抗病基因能够在细胞内识别无毒效应蛋白，包括以下步骤：

(1)将待鉴定信号肽连接无毒效应蛋白C端构建表达载体；

(2)将步骤(1)构建的表达载体转化感受态细胞；

(3)将步骤(2)的感受态细胞和含有抗病基因的感受态细胞共同注射入植物细胞中，观察注射位点坏死情况，若注射位点坏死，则待检测信号肽不具有分泌功能，若注射位点无坏死，则待检测信号肽具有分泌功能。

所述抗病基因为R3a，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，所述无毒效应蛋白为致病疫霉无毒效应蛋白Avr3a，其C端核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示，氨基酸序列如SEQ IDNO.3所示。

步骤(1)所述表达载体为植物瞬时表达载体。

步骤(2)所述感受态细胞为农杆菌感受态。

步骤(3)所述植物为烟草、马铃薯、番茄、辣椒。

本发明提供的利用抗病基因识别无毒效应蛋白以鉴定具有分泌功能信号肽的方法还包括设立阳性对照，所述阳性对照是在步骤(1)阶段，将大豆疫霉无毒效应蛋白Avr1b的信号肽连接无毒效应蛋白C端构建表达载体得到。