[发明专利]一种肺炎多糖疫苗水解液中戊糖、己糖、氨基糖和糖醛酸的含量测定方法

说明书

本发明提供了一种肺炎多糖疫苗水解液中戊糖、己糖、氨基糖和糖醛酸的含量测定方法，该方法适用于23种价态肺炎多糖疫苗水解液中该类化合物的定量检测。方法内容主要为以亲水色谱‑两性离子混合模式固定相为色谱柱，以乙腈、甲酸铵或(和)乙酸铵水溶液为洗脱剂，使得戊糖、己糖、糖醛酸和氨基糖在该固定相上保留，并以质谱为检测器、MRM模式定量。为肺炎多糖疫苗的质量评价提供了新途径。本方法解决了《欧洲药典》方法测定时间长、重复性差、容易受干扰等问题以及己糖含量测定方法缺乏的问题。本方法重复性好和可操作性强，易于实现标准化和产业化，对肺炎多糖疫苗的质量评价和批次重复性控制具有指导意义。

技术领域

本发明具体涉及一种肺炎多糖疫苗水解液中戊糖、己糖、氨基糖和糖醛酸的含量测定方法。属于疫苗质量评价技术领域。

背景技术

肺炎是老人、儿童和艾滋病人重要的致死因素之一。肺炎多糖疫苗的出现极大的减少了该类疾病的发生。目前市面上主要的肺炎多糖疫苗包括23价疫苗和13价疫苗。无论是 23价疫苗还是13价疫苗均需要通过定量各价态疫苗结构单元的含量，进而评价疫苗质量。己糖、戊糖、氨基糖和糖醛酸是肺炎多糖疫苗重要的结构单元。《欧洲药典》采用衍生-紫外分光光度计的方法检测戊糖、氨基糖和糖醛酸。肺炎多糖疫苗中己糖的含量测定方法缺乏。这些方法存在局限性：第一，测定时间较长(大约4小时每个样品)；第二，需要衍生，且无分离，存在方法稳定性和准确性的隐患；第三，不同同时测定己糖、戊糖、氨基糖和糖醛酸，需用三个方法分别测定戊糖、氨基糖和糖醛酸，且无己糖检测方法，耗时、耗力。质量评价方法的稳定性、准确性直接影响疫苗的质量安全。因此，建立一种稳定、准确、抗干扰能力强且可同时检测多种单糖含量的方法，对疫苗的质量评价尤为重要。

肺炎多糖疫苗水解液中单糖的检测中国尚无国家标准，中国生产的该产品采用《欧洲药典》(EP)标准进行检测。EP采用衍生-紫外分光光度计的方法，分别定量戊糖、氨基糖和糖醛酸。这些方法每检测一个样品中的一种糖通常需要4个小时左右，且重复性较差。已报到的单糖检测方法还有高效液相色谱-紫外可见检测(HPLC-UV/Vis)、高效液相色谱-示差折光检测器(HPLC-RID)、高效液相色谱-蒸发光散射检测器(HPLC-ELSD)和离子色谱-电化学检测(IC-ECD)方法。HPLC-UV/Vis方法可提供比EP方法更高的分离选择性，但仍然需要负责的衍生过程，不利于快速检测。HPLC-RID和HPLC-ELSD方法无须衍生即可实现单糖的检测，但这两种方法选择性较差，无法实现复杂基质(如疫苗)中多种单糖的同时检测。IC-ECD无须衍生，且提供比HPLC-UV/Vis、HPLC-RID和HPLC-ELSD更高的选择性，但该方法通常需要较长的分离时间、且难以实现同时定性和定量，以及复杂基质影响定量准确性。

发明内容

本发明的目的是为克服上述现有技术的不足，提供一种肺炎多糖疫苗水解液中戊糖、己糖、氨基糖和糖醛酸的含量测定方法。

为实现上述目的，本发明采用下述技术方案：

一种肺炎多糖疫苗水解液中戊糖、己糖、氨基糖和糖醛酸的含量测定方法，包括以下步骤：

(1)单一标准母液配制：分别称取适量葡萄糖、鼠李糖、葡醛酸、氨基鼠李糖、氨基葡萄糖、2-氨基-5羧基葡萄糖、2-氨基果糖、2,4-二氨基鼠李糖和羧基醚葡萄糖对照品，用乙腈：水(50:50，v/v)混合液溶解，配制成浓度为1mg/mL的母液备用；

(2)单一标准工作溶液的配制：用乙腈：水(50:50，v/v)混合液稀释上述母液到3.9-1000 μg/L浓度范围，得到标准工作溶液，标准工作溶液浓度点分别为1000，500，250，125， 62.6，31.3，15.6，7.8，3.9μg/L；

(3)绘制标准工作曲线：将上述标准工作溶液用高效液相色谱串联质谱进行分析，即可得到上述对照品的色谱图，根据溶液浓度与对应色谱峰面积的关系得到标准工作曲线；