[发明专利]一种L-丝-L-酪环二肽和D-丝-L-酪环二肽的分离提纯方法

说明书

本发明提供了一种L‑丝‑L‑酪环二肽和D‑丝‑L‑酪环二肽的分离提纯方法，包括以下步骤：（1）将穿山甲药材砂炒炮制为炮山甲或醋山甲；（2）将炮山甲或醋山甲打粉，过100目筛，然后通过第一溶剂提取后脱脂得到提取液和药渣，将第一溶剂提取后的药渣再通过第二溶剂提取得到提取液，将两次的提取液合并，减压浓缩得到浸膏；（3）将浸膏用甲醇溶解拌硅胶上柱，并用TLC碘显色监控；（4）将步骤（3）得到的流份用反相高效液相色谱纯化，以乙睛‑水流动相，洗脱液减压浓缩除去乙睛和水，干燥，得到L‑丝‑L‑酪环二肽和D‑丝‑L‑酪环二肽。

技术领域

本发明涉及中药有效成分提取领域，具体涉及一种L-丝-L-酪环二肽和D-丝-L-酪环二肽的分离提纯方法。

背景技术

穿山甲来源于鲮鲤科动物中华穿山甲的鳞甲，需砂炒方可入药，有活血消癥之功，临床疗效确切。穿山甲在高温砂炒过程中，新增了L-丝-L-酪环二肽，D-丝-L-酪环二肽。

环二肽作为一类活性物质，目前受了越来越多的关注，表现出了抗炎、抗肿瘤、抗凝、神经保护、免疫调节等多种显著的生物活性。由于角蛋白特殊的分子结构使角蛋白难以消化分解,当把角蛋白分解为多肽或氨基酸时方可消化吸收，穿山甲角蛋白在炮制过程中，由于温度升高，蛋白质吸收的能量超过了分子间作用力，导致肽键断裂，从而引起蛋白变性。蛋白炮制产物进入人体后，肠道内对蛋白质的利用并不局限于游离氨基酸的形式，而大部分是以寡肽形式吸收的，在消化过程中，L-丝-L-酪环二肽，D-丝-L-酪环二肽可以通过肠道吸收而进入血液循环从而在全身发挥作用，也可以在胃肠道中产生局部效应，吸收速度比相同组成的氨基酸更快。其吸收机制优于蛋白质和氨基酸。

发明内容

要解决的技术问题：本发明的目的是提供从穿山甲中简便易行分离纯化L-丝-L-酪环二肽和D-丝-L-酪环二肽的方法。

技术方案：一种L-丝-L-酪环二肽和D-丝-L-酪环二肽的分离提纯方法，包括以下步骤：

（1）将穿山甲药材砂炒炮制为炮山甲或醋山甲；

（2）将炮山甲或醋山甲打粉，过100目筛，然后通过第一溶剂提取后脱脂得到提取液和药渣，将第一溶剂提取后的药渣再通过第二溶剂提取得到提取液，将两次的提取液合并，减压浓缩得到浸膏；

（3）将浸膏用甲醇溶解拌硅胶上柱，固定相为200-300目硅胶，流动相为二氯甲烷：丙酮：乙醇体积比为1-20:1-2:1洗脱，并用TLC碘显色监控，合并二氯甲烷-丙酮-乙醇的体积比为10:2:1的流份；

（4）将步骤（3）得到的流份用反相高效液相色谱纯化，以乙睛-水流动相，洗脱液减压浓缩除去乙睛和水，干燥，得到纯度96%以上的L-丝-L-酪环二肽和D-丝-L-酪环二肽。

进一步的，所述步骤（2）中第一溶剂为二氯甲烷，将炮山甲或醋山甲粉加入5-10倍量的二氯甲烷提取3-5次，每次1小时。

进一步的，所述步骤（2）中第二溶剂为浓度为50wt%的乙醇，将药渣加入5-10倍重量份的50%乙醇提取4-5次，每次1小时。

进一步的，所述步骤（3）中每10g浸膏用50ml甲醇溶解，用20g硅胶拌匀。

进一步的，所述步骤（4）中反相高效液相色谱条件为：柱温30℃，检测波长210nm或230nm。

进一步的，所述步骤（4）中乙睛-水流动相为浓度为1-4wt%乙腈水溶液，洗脱液洗脱流速为2-6ml/min，洗脱时间20-60分钟。

有益效果：本发明以穿山甲炮制品为原料分离纯化L-丝-L-酪环二肽，D-丝-L-酪环二肽，方法简单，成本低，具有可持续性，制得的化L-丝-L-酪环二肽，D-丝-L-酪环二肽纯度高均大于97%和96%，对进一步开展 L-丝-L-酪环二肽，D-丝-L-酪环二肽药理学研究和穿山甲替代资源的寻找具有重要意义。

附图说明