[发明专利]鉴别刺山柑和薄叶山柑的方法及其应用在审
| 申请号： | 201810059569.3 | 申请日： | 2018-01-22 |
| 公开（公告）号： | CN108165608A | 公开（公告）日： | 2018-06-15 |
| 发明（设计）人： | 程波;杨伟俊;何江;刘冲;满尔哈巴·海如拉;地力努尔·吐尔逊江;徐荣 | 申请（专利权）人： | 新疆维吾尔自治区药物研究所 |
| 主分类号： | C12Q1/6806 | 分类号： | C12Q1/6806;G06F19/24 |
| 代理公司： | 北京中誉威圣知识产权代理有限公司 11279 | 代理人： | 叶立涛;高清峰 |
| 地址： | 830004 新疆维吾尔*** | 国省代码： | 新疆;65 |
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| 摘要： | |||
| 搜索关键词： | 刺山柑 薄叶 鉴别 核苷酸序列 药材 方法适用性 系统发育树 叶绿体DNA 品种鉴定 有效解决 种质资源 构建 应用 改良 成功 开发 | ||
1.一种鉴别刺山柑和薄叶山柑的方法，其特征在于，包括使用PCR扩增叶绿体DNA的psbA-trnH核苷酸序列，以及构建psbA-trnH核苷酸序列的系统发育树。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：
(1)提取样品总DNA；
(2)以总DNA为模板，PCR扩增psbA-trnH核苷酸序列；
(3)对扩增产物进行测序、拼接，获得psbA-trnH基因间隔区核苷酸序列；以及
(4)构建样品的psbA-trnH核苷酸序列的系统发育树。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述样品为刺山柑和薄叶山柑。
4.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，PCR扩增的特异性引物为：
F：5’-GTTATGCATGAACGTAATGCTC-3’(即SEQ ID NO.1)；
R：5’-CGCGCATGGTGGATTCACAATCC-3’(即SEQ ID NO.2)。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，PCR扩增的体系为：
2.5mmol/L的10×PCR Buffer 2-3μL，2.5mmol/L的dNTPs 1.5-2.5μL，10μmol/L的PCR扩增的特异性引物各0.3-0.7μL，DNA模板2-4μL，5U/μL的Taq DNA聚合酶0.2-0.3μL，补ddH2O至25μL。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，PCR扩增的体系为：
2.5mmol/L的10×PCR Buffer 2.5μL，2.5mmol/L的dNTPs 2μL，10μmol/L的PCR扩增的特异性引物各0.5μL，DNA模板3μL，5U/μL的Taq DNA聚合酶0.25μL，补ddH2O至25μL。
7.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，PCR扩增的条件为：94℃预变性3-7min；94℃0.5-1.5min，55℃0.5-1.5min，72℃1-2min，共29-32个循环；72℃延伸5-9min；最终置于12℃。
8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，PCR扩增的条件为：94℃预变性5min；94℃1min，55℃1min，72℃1.5min，共30个循环；72℃延伸7min；最终置于12℃。
9.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，使用序列对比软件，构建待测样品的psbA-trnH序列的系统发育树，通过系统发育树鉴别出刺山柑与薄叶山柑。
10.权利要求1-9任一项所述的方法在鉴别刺山柑与薄叶山柑的基原植物、果实、根皮、茎中的用途。
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