[发明专利]一种阴离子多肽羧基化生物纳米磁珠及其制备方法

权利要求书

1.一种阴离子多肽羧基化生物纳米磁珠，其特征在于，所述阴离子多肽羧基化生物纳米磁珠由嫁接有聚乙二醇的阴离子多肽聚合物通过柔性linker连接到生物纳米磁珠的膜蛋白上融合表达而成，所述柔性linker的氨基酸残基为GCVA(DLGGV)₂GVC(GA)₃MADEGAG。

2.如权利要求1所述的阴离子多肽羧基化生物纳米磁珠，其特征在于，所述阴离子多肽聚合物的氨基酸残基为

3.如权利要求1所述的阴离子多肽羧基化生物纳米磁珠，其特征在于，所述阴离子多肽聚合物的氨基酸残基为

4.一种权利要求1所述的阴离子多肽羧基化生物纳米磁珠的制备方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：

A、构建细菌磁颗粒膜蛋白基因mamC或mamF缺失的突变体菌株，得到一级重组菌株；

B、通过DNA合成的方法制备阴离子多肽，将阴离子多肽与细菌磁颗粒膜蛋白基因mamC或mamF通过柔性linker进行融合形成基因融合表达载体；

C、将步骤B得到的表达载体导入到步骤A得到的一级重组菌株中，筛选出表达阴离子多肽的二级重组菌株；

D、将步骤C得到的二级重组菌种进行发酵培养，分离纯化生产表达展示阴离子多肽的改性生物纳米磁珠；

E、采用多聚物糖基化聚乙二醇对步骤D所得到的改性生物纳米磁珠进行嫁接修饰形成具有壳结构的所述阴离子多肽羧基化生物纳米磁珠。

5.如权利要求4所述的制备方法，其特征在于，所述菌株选择MSR-Ⅰ野生型菌株，所述步骤A的具体方法包括如下步骤：

(a-1)基因敲除：扩增细菌磁颗粒膜蛋白mamC或mamF基因左右两侧共两个长均为300-700bp的同源DNA片段，将所述DNA片段克隆在噬菌体病毒AAV-del微载体上，即得一条基于噬菌体病毒的微载体序列AAV-del-mac或AAV-del-maf；

(a-2)基因转移：获取AAV-del-mac或AAV-del-maf的核酸序列产物，调节核酸序列产物的浓度为1-3mg/ml，通过电转化的方式转入MSR-Ⅰ野生菌株中；

(a-3)菌株筛选：经过梯度筛选，获得mamc或mamf缺失突变的重组菌株，验证后即得一级重组菌株MSRⅠ-dC或MSRⅠ-dF。

6.如权利要求5所述的制备方法，其特征在于，所述电转化的具体方案为：采用方波电脉冲，电压为3100V-3200V，电脉冲时间是3.1-3.3ms，电脉冲次数是1-2次。

7.如权利要求4所述的制备方法，其特征在于，所述步骤D包括如下具体步骤：

d-1、预培养：将步骤C得到的二级重组菌株接种到经过灭菌后的第一培养基中培养14-18h后得到预培养菌株，预培养条件为：温度35-38℃，通气量为每分钟每1mL培养基通入0.3-0.5mL的气体，所述气体为5％-10％O₂和90％-95％N₂的混合气体；

d-2、将所得的预培养菌株接种至装有灭菌第二培养基的发酵罐中进行深层培养3-4天后得到深层培养物，所述深层培养条件为：温度34-37℃，通气量为每分钟每1mL培养基通入0.4-0.6mL的气体，所述气体为5％O₂、1％H₂和94％N₂的混合气体；

d-3、将得到的深层培养物依次进行菌体粉碎、磁力吸附和梯度纯化步骤，最终得到所述表达展示阴离子多肽的改性生物纳米磁珠。

8.如权利要求7所述的制备方法，其特征在于，所述第一培养基由重量份数为1-2份腐胺二盐酸盐、0.1-0.2份多氯化胆碱、7-8份D-葡萄糖、1-2份亚油酸、2-3份硫代甘油、0.5-1份乙酸钠、3-5琼脂和1-2份海藻酸铵组成；所述第二培养基由重量份数为2-3份右旋糖酐、2-3份吐温80、0.3-0.5份甲砜霉素、7-8份D-葡萄糖、1-2份亚油酸、2-3份海藻糖和1-2份硫代甘油组成。

9.如权利要求4所述的制备方法，其特征在于，所述步骤E由如下分步骤构成：

e-1、取20-30mg的生物纳米磁珠溶于10-12mL磷酸缓冲液中，加入1-1.5mL浓度为9mM的N乙酰羧基糖，室温搅拌30min；

e-2、加入N乙酰羧基糖转移酶，至终浓度35-45mU，室温搅拌3-5h，得到UDP-GalNAc定点修饰的生物纳米磁珠；

e-3、将步骤e-2得到的生物纳米磁珠采用磁力架分离纯化，洗涤后，重新溶于10-12mL磷酸缓冲液中，加入1-2mL浓度为2.5mM的唾液酸活化PEG，搅拌混匀；然后加入唾液酸转移酶，至终浓度200-280mU，于32℃，以50-80rpm的速度，轻轻摇晃反应24-48小时，催化形成具有PEG聚合物外壳的生物纳米磁珠；

e-4、将步骤e-3得到的生物纳米磁珠用25％乙醇洗涤2-3次，即得所述具有壳结构的阴离子多肽羧基化生物纳米磁珠。