[发明专利]用于定量检测痢疾性阿米巴虫的引物探针、试剂盒及方法

说明书

本发明公开了痢疾性阿米巴虫荧光定量PCR检测试剂盒及非诊断性检测方法，所述试剂盒包括PCR反应液，所述PCR反应液包括具有如下核苷酸序列的引物和Taqman探针：上游引物：5’‑ATGACTCAAAAACAGGAACAT‑3’，下游引物：5’‑TACAAATTTACCACTTTCACATACTG‑3’，Taqman探针：5’‑AGCAACTGTTCAACCAACACCAGCATGT‑3’。本发明能够快速、有效地检测痢疾性阿米巴虫，所述非诊断性检测方法准确性、特异性和敏感性高，所述检测试剂盒灵敏、稳定、有效。

技术领域

本发明涉及寄生虫的分子生物学检测技术领域，特别是涉及一种用于定量检测痢疾性阿米巴虫的引物组、试剂盒及方法。

背景技术

溶组织内阿米巴虫(Entamoeba histolytica)又称痢疾阿米巴虫，主要寄生于结肠内，引起阿米巴痢疾或阿米巴结肠炎。全世界约有5000万人感染，每年导致10万人死亡，其死亡率在原虫寄生虫中的患者中仅次于疟疾。

目前检测痢疾性阿米巴虫所采用的方法主要还是传统常规的分离培养观察鉴定、Elisa方法及普通PCR检测。传统常规的分离培养鉴定法，操作烦琐、耗时长、漏诊率高；ELISA方法相对简便、快速，但对于微量或杂质较多的样品，其特异性和灵敏度较低，可能造成误判。 PCR作为一种新型的分子生物学技术，自诞生以来，由于它的特异性、敏感性高，能在短时间内得到大量的目的片段，使之成为当今发明研究的重要手段之一。但常规的PCR在操作中容易造成污染，假阳性较高，使之在检测上受到一些限制。因此，有必要建立一种快速、灵敏、准确度高的痢疾性阿米巴虫检测方法。

发明内容

本发明的一个目的是提供痢疾性阿米巴虫荧光定量PCR检测试剂盒，使其能够快速、有效地对痢疾性阿米巴虫进行检测，准确性、特异性和敏感性高，稳定性好。

为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

一种用于定量检测痢疾性阿米巴虫的引物组，包括：核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示的上游引物、核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示的下游引物，以及核苷酸序列如SEQ IDNO.3 所示的探针引物。

用于定量检测痢疾性阿米巴虫的试剂盒，其包括所述的引物组。

所述试剂盒还包括核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示的探针；所述定量检测指荧光定量 PCR检测。

所述探针的核苷酸序列的3’端标记BHQ1荧光淬灭基团，5’端标记FAM荧光报告基团。

所述试剂盒，还包括用于进行荧光定量PCR检测的常规试剂。

所述常规试剂包括DNA聚合酶、缓冲液、dNTP、双蒸水；和/或，包括所述DNA聚合酶、缓冲液、dNTP、双蒸水在内的商品化PCR反应混合液；

所述商品化PCR反应混合液为2×Premix EX Taq。

一种用于定量检测痢疾性阿米巴虫的方法，其特征在于，采用所述的引物，和/或，所述的试剂盒对待测样品进行检测。

所述检测指荧光定量PCR检测；所述荧光定量PCR的反应体系包括：上游引物终浓度 0.2μM；下游引物终浓度0.2μM；Taqman探针终浓度0.2μM；所述待测样品的DNA 10-100μg；2×Premix EX Taq终浓度为0.5μl/μl，余量为灭菌去离子水。

所述荧光定量PCR的反应程序包括：95℃30s；以95℃5s，60℃34s，为1个循环，共进行40个循环，所述第二步每个循环的延伸结束时进行荧光信号检测。