[发明专利]基于LAMP的自吸式多通道病原菌检测微流控芯片

权利要求书

1. 基于LAMP的自吸式多通道病原菌检测微流控芯片，它包括：进样层（1）、反应层（2）和支撑层（3）；进样层（1）包括进样层Ⅰ（11）、防蒸发膜（8）和进样层Ⅱ（13），所述的进样层（1）中心设有进样口（4），进样层Ⅱ（13）设有若干进样通道（5）；反应层（2）内设有若干反应室（6），圆形滤纸片（7）设在反应室（6）内；进样层Ⅰ（11）、进样层Ⅱ（13）和反应层（2）为PDMS材料；进样口（4）通过进样通道（5）与反应室（6）相通；进样层（1）上设有封闭膜（9）；

所述的圆形滤纸片（7）包被了引物。

2.根据权利要求1所述的基于LAMP的自吸式多通道病原菌检测微流控芯片，其特征在于：防蒸发膜（8）为含氟聚合物Novec。

3.根据权利要求2所述的基于LAMP的自吸式多通道病原菌检测微流控芯片，其特征在于：所述的封闭膜（9）为胶带；支撑层（3）为玻璃。

4.根据权利要求1、2或3所述的基于LAMP的自吸式多通道病原菌检测微流控芯片，其特征在于：所述的反应室（6）为2-8个。

5.根据权利要求4所述的基于LAMP的自吸式多通道病原菌检测微流控芯片，其特征在于：所述的进样通道（5）长3~5mm、宽200μm、高115μm；进样层（1）厚度1.5mm，进样口（4）的直径1mm，芯片尺寸为20×20×2.5mm³。

6.权利要求1所述的基于LAMP的自吸式多通道病原菌检测微流控芯片的制备方法：

1）进样层的制备

加工进样通道的阳模，在该阳模上浇注PDMS；待固化后，表面旋涂含氟聚合物Novec形成纳米级防蒸发膜；晾干后，再在其表面浇注PDMS，固化；将PDMS和Novec复合物从阳模上小心揭下，于中心处打孔，制得进样层；

2)反应层的制备

在干净的硅片上浇注适量PDMS，固化后，揭下；打孔，形成反应室，将圆形滤纸片裁剪成放于其中；

3)芯片的组装

将反应层的一侧与玻璃支撑层封接；随后，反应层的另一侧与进样层的进样通道侧封接；封接时，要保证进样通道末端与反应室相连。

7.权利要求1所述的基于LAMP的自吸式多通道病原菌检测微流控芯片的检测方法，它包括：

1）将引物滴加到圆形滤纸片（7）上，晾干；放入反应室（6）中；组装芯片；

2）使用封闭膜（9）密封进样口（4）；将芯片置于真空干燥机中，除气；

3）使用移液器吸取LAMP反应液，将吸有反应液的吸头刺入封闭膜（9），在气压的驱动下，反应液被自动吸入芯片；随后，在吸头内的反应液液面上方注入密封油；反应液完全进入芯片后，密封油也会随之进入，并封闭进样通道，从而达到防止反应室间交叉污染和防止反应液蒸发的作用；待反应液全部进入反应室，且密封油充满进样通道时，拔去吸头，重新使用封闭膜（9）封闭进样口（4）；

4）处理后的芯片放置在加热板上，60-70℃恒温反应0.5-2小时。

8. 根据权利要求7所述的基于LAMP的自吸式多通道病原菌检测微流控芯片的检测方法，其特征在于：所述的LAMP反应液为8μL，含有如下成分：0.8M甜菜碱，1.4 mM dNTP溶液，0.8 μL 10 ×等温扩增缓冲液，6 mM 硫酸镁溶液，0.16 μL 10 ×SYBR Green I荧光染料，300 μM 羟基萘酚蓝溶液，2.56 U Bst 2.0 热启动DNA聚合酶，1.6 μL样品DNA提取液；

所述的引物为对应金黄色葡萄球菌SA特征序列的LAMP引物：

F3-nuc：TGGCTATCAGTAATGTTTCGA

B3-nuc：TTAATTAATGTCGCAGGTTCTT

LF-nuc：GTTAACACTAAGCAACTAG

LB-nuc：CGGCGTAAATAGAAGTGATTCTGAA

FIP-nuc：

GAGCTACTTAGACTTGAAGCTACAACAAAGAGGTTTTTCTTTTTCGC

BIP-nuc：GCAAATGCATCACAAACAGGTAATTTTAGTTGAAGTTGCACTGTA；

或对应副溶血性弧菌VP特征序列的LAMP引物，

F3-tlh：AGCTACTCGAAAGATGATCC

B3-tlh：GGTTGTATGAGAAGCGATTG

LF-tlh：ACCAGTAGCCGTCAATG

LB-tlh：TTAGATTTGGCGAACGAGA

FIP-tlh：ATGTTTTTAAATGAAACGGAGCTCCGGCAAAAAACGAAGATGGT

BIP-tlh：ACGTCGCAAAACGTTATCCGGCGAAGAACGTAATGTCTG。