[发明专利]一种与肾病相关的肠道菌群代谢物的检测方法

权利要求书

1.一种与肾病相关的肠道菌群代谢物的检测方法，其特征在于，包括如下流程步骤：

(1)取血清样本40-100μL，加入160-400μL提取剂甲醇，该提取剂甲醇中溶解有左旋肉碱-d3及马尿酸-d5内标，涡旋，离心吸取上清液冻干；

(2)向冻干物中加入50-100μL甲醇水溶液复溶，离心取上清液后利用液相色谱质谱联用仪分析；

步骤(2)中采用的液相色谱分离条件为：采用五氟苯基色谱柱，规格为长度150mm、内径2.1mm、粒径3μm，流速0.2-0.35mL/min，柱温35-45℃，进样体积为0.1-5μL；流动相A相为含0.1％体积甲酸的水溶液，B相为含0.1％体积甲酸的乙腈溶液，采用梯度洗脱，起始流动相为体积浓度0％B，维持2min，然后在3min内线性升高到25％B，接着在6min内继续升高到35％B，然后在4min内继续升高到95％B，维持3min，然后在0.1min内恢复到0％B，平衡4min；

步骤(2)中采用的质谱为三重四级杆串联质谱，质谱检测条件为：采用电喷雾源正负离子同时采集模式，离子源接口电压4.0kV，雾化气为氮气，流速3L/min，干燥气同为氮气，流速为10L/min，加热气为空气，10L/min，碰撞气为氩气，压力为270KPa，脱溶剂管温度250℃，加热模块温度400℃，多反应监测模式采集参数为：三甲胺N-氧化物离子对7658.15，碰撞能-22V，N-苯乙酰基-L-谷氨酰胺离子对265.1129.95，碰撞能-14V，马尿酸离子对180.1105.05，碰撞能-13V，苯乙酰甘氨酸离子对194.191.05，碰撞能-26V，肉桂酰甘氨酸离子对206.1131.05，碰撞能-11V，硫酸吲哚酚离子对21279.9，碰撞能20V，对甲酚硫酸盐离子对187106.95，碰撞能20V，左旋肉碱-d3离子对165.185.15，碰撞能-21V及马尿酸-d5离子对185.2110.2，碰撞能-13V。

2.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于：步骤(1)所用提取剂甲醇中含有0.1-0.5μg/mL左旋肉碱-d3及0.5-2μg/mL马尿酸-d5作为内标。

3.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于：步骤(1)中血清经提取、离心后，用于冻干的上清液量为血清样本量3-4倍。

4.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于：步骤(2)冻干物复溶所用甲醇水的量与步骤(1)中血清样本量相同，复溶剂中甲醇与水的体积比例为1:10-1:8。

5.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于：液相色谱进样体积为0.1-5μL。

6.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于：肠道菌群代谢物采用内标法定量，左旋肉碱-d3作为三甲胺N-氧化物内标，马尿酸-d5作为N-苯乙酰基-L-谷氨酰胺、马尿酸、苯乙酰甘氨酸、肉桂酰甘氨酸、硫酸吲哚酚、对甲酚硫酸盐六种物质内标，根据线性曲线进行定量计算与肾病相关的肠道菌群代谢物三甲胺N-氧化物、N-苯乙酰基-L-谷氨酰胺、马尿酸、苯乙酰甘氨酸、肉桂酰甘氨酸、硫酸吲哚酚、对甲酚硫酸盐的含量。

7.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于：线性曲线的建立过程为配置各肠道菌群代谢物的浓度为0.5-50μg/mL，用体积浓度为5％-20％甲醇稀释配置成6-10个浓度标品，逐级稀释5-50000倍,其余步骤同权利要求1中血清样本处理过程。