[发明专利]一种从人母乳样本中提取微生物MetaDNA的方法

说明书

本发明公开了一种从人母乳样本中提取微生物MetaDNA的方法，包括以下步骤：步骤一，提取母乳样本；步骤二，离心浓缩样本；步骤三，裂解样本；步骤四，离心柱结合；步骤五，高盐溶液洗涤；步骤六，洗涤静置；步骤七：DNA回溶。本发明通过使用QIAamp Fast DNA Stool Mini Kit DNA快速提取试剂盒，不会影响样本中DNA的提取量、完整性、肠道菌群丰度和多样性指数的检测结果，保证了数据的准确性，通过使用市面上常见的QIAamp Fast DNA Stool Mini Kit试剂盒，进行提取流程的优化和改进，最终提取出母乳中的微生物Meta DNA，并且通过PCR进行了鉴定，以证明该方案的可行，本发明的提取成功率极高，保证了实验数据的准确性，极大的提高了提取过程的效率，同时减少了不必要的资源浪费。

技术领域

本发明涉及母乳样本提取的方法，特别涉及一种从人母乳样本中提取微生物MetaDNA的方法。

背景技术

人类乳汁中含有丰富的营养成分和保护因子，对于新生儿的成长和发育至关重要。此外母乳中有高达数百种细菌,而且包括一些常见的病原菌。现有的研究认为母乳是影响新生儿肠道发育和免疫系统成熟的关键因素，其中微生物起到了至关重要的作用。母乳中的微生物具有抑制其他有害病原菌的生长，调节免疫系统，帮助消化，保护肠道健康等多种有益作用。但是，另一方面，如果母亲自身携带一些传染性疾病或病毒，极大可能会通过哺乳传染给婴儿。例如，如果母亲为乙型肝炎病毒(HBV)携带者，可能会通过喂养导致新生儿感染乙型病毒性肝炎，中国每年约有80万儿童通过乳汁感染而成为HBV携带者，约占中国婴幼儿HBV感染的1/3。因此对于母乳中微生物的种类、来源及作用，对新生儿肠道健康、抗生素替代、及临床疾病的预防等研究均有着重要的作用，因此，发明一种从人母乳样本中提取微生物MetaDNA 的方法来解决上述问题很有必要。

发明内容

本发明的目的在于提供一种从人母乳样本中提取微生物MetaDNA的方法，以解决上述背景技术中提出的问题。

为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：一种从人母乳样本中提取微生物MetaDNA的方法，包括以下步骤：

步骤一，提取母乳样本：将母乳样本放置在样本微生物提取试剂盒中存储，并分装40μL蛋白酶K至一个灭菌的2.0ml离心管中；

步骤二，离心浓缩样本：

a:室温解冻母乳样本，震荡混匀，准备另一个新的灭菌的2.0ml离心管分装1ml的母乳样本，85mg样本在微量离心机中离心10min；

b:离心后，样本将分为三层，最上层为黄白色的脂肪层，中间为澄清的液体，最下层为白色的沉淀，吸取800μL样本中间层到分装好的蛋白酶K的离心管中，上下颠倒混匀；

步骤三，裂解样本：

a:向离心浓缩完成后的混合溶液中加入800μL Buffer AL，涡旋震荡，充分混匀15s；

b:使用加热器70℃孵育10min；

c:从加热器中取出样本管，震荡混匀，分装成两管，每管820μL；

d:每管样本加入820μL无水乙醇，涡旋震荡15s充分混匀，放入-20℃冰箱冷处理15min；

步骤四，离心柱结合：将冷处理后的样本溶液转移700μL至纯化柱中过柱，12500rcf离心30s，离心后弃废液和收集管，转移纯化柱至新的收集管中，继续将冷处理后的样本溶液转移700μL至纯化柱中过柱，直至溶液全部过柱；

步骤五，高盐溶液洗涤：

a:向纯化柱中加入500μL Buffer AW1，20000rcf离心1min,弃去废液和收集管，转移纯化柱至一个新的收集管中；