[发明专利]一种NOD遗传背景的动脉粥样硬化小鼠模型的制备方法

权利要求书

1.一种NOD遗传背景的动脉粥样硬化小鼠模型的制备方法，其特征在于：包括：将NOD小鼠中ApoE基因和LDLR基因同时敲除；

在敲除所述ApoE基因时采用CRISPR/Cas9系统，选择3个靶序列，分别如下所示：

ApoE-sgRNA1：5‘-CCTAGCCGAGGGAGAGCCGG AGG-3’；

ApoE-sgRNA2：5‘-GTAATCCCAGAAGCGGTTCA GGG-3’；

ApoE-sgRNA3：5‘-CTTCTGGGATTACCTGCGCT GGG-3’；

在敲除所述LDLR基因时采用CRISPR/Cas9系统，选择3个靶序列，分别如下所示：

LDLR-sgRNA1：5‘-TCCATCACACACAAACTGCG GGG-3’；

LDLR-sgRNA2：5‘-AGTTGCAGCGGAAGTGGGCG GGG-3’；

LDLR-sgRNA3：5‘-CAGTCTTTGGGCCTGCGACG GGG-3’；

在共同敲除ApoE基因和LDLR基因时，合成7条引物，通过PCR扩增得到6个双链DNA；将所述6个双链DNA转录成6个sgRNA mRNA，将所述6个sgRNA mRNA与Cas9 mRNA共同注射入小鼠受精卵细胞中，得到双基因敲除受精卵细胞；将所述双基因敲除受精卵细胞移植进入假孕雌鼠输卵管，出生后获得F0小鼠；

所述引物分别如下所示：

ApoE-IVT-1：TTAATACGAC TCACTATAGG GCCTAGCCGA GGGAGAGCCG GGTTTTAGAGCTAGAAATAG CAAG；

ApoE-IVT-2：TTAATACGAC TCACTATAGG GGTAATCCCA GAAGCGGTTC AGTTTTAGAGCTAGAAATAG CAAG；

ApoE-IVT-3：TTAATACGAC TCACTATAGG GCTTCTGGGA TTACCTGCGC TGTTTTAGAGCTAGAAATAG CAAG；

LDLR-IVT-1：TTAATACGAC TCACTATAGG GTCCATCACA CACAAACTGC GGTTTTAGAGCTAGAAATAG CAAG；

LDLR-IVT-2：TTAATACGAC TCACTATAGG GAGTTGCAGC GGAAGTGGGC GGTTTTAGAGCTAGAAATAG CAAG；

LDLR-IVT-3：TTAATACGAC TCACTATAGG GCAGTCTTTG GGCCTGCGAC GGTTTTAGAGCTAGAAATAG CAAG；IVT-R：AAAAAAGCACCGACTCGGTGCC；

将所述IVT-R分别与ApoE-IVT-1、ApoE-IVT-2、ApoE-IVT-3、LDLR-IVT-1、LDLR-IVT-2或LDLR-IVT-3组合后用于PCR扩增，获得6个双链DNA；

将所述双基因敲除受精卵细胞移植至假孕雌鼠，得到F0小鼠后，鉴定选择ApoE和LDLR双基因同时敲除的F0小鼠与NOD小鼠交配得到F1代杂合子小鼠，再在将F1代杂合子小鼠进行自交，筛选出ApoE和LDLR双基因同时敲除的纯合子个体即为NOD遗传背景的动脉粥样硬化小鼠模型。

2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于：所述Cas9 mRNA为由pST1374-cas9载体经Agel酶线性化后，在体外转录获得。

3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于：所述PCR扩增时，采用的模板为pX330质粒。

4.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于：所述ApoE基因的鉴定使用如下引物：

ApoE-FPCR-F：5‘-CGAGGGTGAAAGAGCTGGAC-3’；

ApoE-FPCR-R：5‘-GCCTCCAGACCCACTTCAAA-3’。