[发明专利]一种胎盘亚全能干细胞与间充质干细胞混合培养提取物的修复制剂及其制备方法在审

专利信息
申请号: 201810065991.X 申请日: 2018-01-24
公开(公告)号: CN108272823A 公开(公告)日: 2018-07-13
发明(设计)人: 刘俊江;曹毓琳;时兆田;王沾;白志惠 申请(专利权)人: 北京臻溪谷医学研究中心(有限合伙)
主分类号: A61K35/28 分类号: A61K35/28;A61K35/50;A61P17/02;A61P17/10;A61K8/99;A61Q19/02;A61Q19/08;C12N5/0735
代理公司: 北京爱普纳杰专利代理事务所(特殊普通合伙) 11419 代理人: 王玉松;韩丽颖
地址: 100032 北京市西城*** 国省代码: 北京;11
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摘要:
搜索关键词: 间充质干细胞 亚全能干细胞 混合培养 胎盘 提取物 制备 培养液 修复制剂 皮肤 无血清培养基 有效成分含量 传代 痤疮 修复 冻干制剂 皮肤损伤 治疗效果 创伤性 美白 安全
【权利要求书】:

1.一种胎盘亚全能干细胞与间充质干细胞混合培养提取物的修复制剂,其特征在于,所述修复制剂包括如下重量分的组分:胎盘亚全能干细胞与间充质干细胞混合培养提取物50-70和填充剂20-30;

所述胎盘亚全能干细胞与间充质干细胞混合培养提取物的制备方法如下:

1)无菌采集胎盘组织,经过清洗、消化和分离步骤获得胎盘亚全能干细胞;

2)无菌采集胎盘组织,经过清洗、消化和分离步骤获得间充质干细胞;

3)将胎盘亚全能干细胞按照2×104个/ml的密度、间充质干细胞按照8×104个/ml的密度,共同接种于原代无血清培养液中,每隔1-3天换液一次,培养7-10天,收获原代混合细胞,并将培养三天后的经过培养的培养液进行收集并合并,得到原代培养液;

4)将收获的原代混合细胞按照1×105个/ml的密度接种于传代无血清培养液中,传代至第五代,每代的经过培养的培养液均进行收集并合并,得到传代培养液;

5)将收集到的原代培养液和传代培养液进行混合,灭菌后,向培养液中加入浓度为8-12mg/ml的棉籽糖、浓度为0.05-0.1mg/ml的枯草杆菌和浓度为0.03-0.08ml/ml的磷酸二氢铵,混合均匀后,于15℃、35%O2的潮湿空气静置10-15天,得到混合培养预混物;

6)将得到的混合培养预混物进行离心操作,收集上清液,灭菌即得所述胎盘亚全能干细胞与间充质干细胞混合培养提取物。

2.如权利要求1所述胎盘亚全能干细胞与间充质干细胞混合培养提取物的修复制剂,其特征在于,所述原代无血清培养液以OPTI-MEM培养液为基础,还包括如下浓度的组分:15-20ug/mL D-葡萄糖、13-20ug/mL大豆磷脂和8-12ug/mL苯丙氨酸。

3.如权利要求2所述胎盘亚全能干细胞与间充质干细胞混合培养提取物的修复制剂,其特征在于,所述步骤3)具体包括如下步骤:

3.1)将胎盘亚全能干细胞按照2×104个/ml的密度、间充质干细胞按照8×104个/ml的密度与培养液进行混合,得到混合细胞悬液,并接种于无血清培养液中;

3.2)在37℃、5%CO2的潮湿空气中进行培养,第二天更换全部培养液,向培养液中加入18ug/ml的多聚尿氨酸,继续培养2天后,更换二分之一培养液,然后每隔3天更换二分之一培养液,同时在换液的同时缓慢送含有6%CO2的气体,培养7-10天后,离心收集上清液;

3.3)将培养第4天及其后更换的培养液进行收集,然后与上清液进行合并。

4.如权利要求1-3任一所述的胎盘亚全能干细胞与间充质干细胞混合培养提取物的修复制剂,其特征在于,所述修复制剂为冻干制剂,所述填充剂包括重量份数比为:2:1:5的金丝桃苷、枸缘酸钠和葡糖胺葡聚糖。

5.如权利要求4所述的胎盘亚全能干细胞与间充质干细胞混合培养提取物的修复制剂,其特征在于,所述修复制剂的制备方法包括如下步骤:

1)溶液A获取步骤:在0℃条件下,无菌条件下,按照重量份数将枸缘酸钠溶于水中,至质量浓度为1.5%,然后将金丝桃苷和葡糖胺葡聚糖加入到枸缘酸钠水溶液中进行混合,混合均匀后,加入胎盘亚全能干细胞与间充质干细胞混合培养提取物,搅拌混合10-15min,得到溶液A;

2)装罐步骤:将步骤1)得到的溶液A过滤除菌三次,分装至储罐,将储罐在摇晃状态下降温至-5~-7℃,保持10min;

3)预冻步骤:将隔板温度降至-7℃进箱,然后将步骤2)处理后的储罐放置于隔板上,进行分步预冻,在-15~-18℃条件下保温70-90min;然后在-25~-27℃条件下保温120-150min;最后在-45℃条件下保温50-60min;

4)一次干燥:调整冻干机的真空压力为25-30Pa,温度为-25℃~-30℃,持续12-15h;

5)二次干燥:调整冻干机的真空压力为5-10Pa,温度为30℃,持续6-12h。

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