[发明专利]一种人脂肪干细胞的获取分离培养方法和干细胞库的构建方法

说明书

技术领域

本发明属于医学和生物学技术领域，特别涉及一种人脂肪干细胞 的获取分离培养方法和干细胞库的构建方法。

背景技术

干细胞是一类具有自我复制能力的多潜能细胞，在一定条件下， 它可以分化为多种功能细胞。干细胞即为起源细胞，简单来讲，它是 具有多向分化潜能和自我复制能力的原始的未分化细胞，是形成哺乳 类动物的各组织器官的原始细胞。脂肪干细胞是从脂肪组织获得的一 类有多向分花潜能的干细胞，其在特定诱导条件下可分化为成骨细胞、 成软骨细胞和脂肪细胞等。Zuk2001年首次通过分离人脂肪组织获得 了此类具有细胞治疗潜能的干细胞，从而开创了脂肪干细胞研究和应 用的先河。

目前，现有的人体脂肪干细胞的分离及培养均存在组织消化低， 脂肪干细胞的增值缓慢，细胞分化严重，细胞培养过程中存活率低， 此外，为了便于人们有效储存和使用干细胞资源，目前在世界范围内， 已经建立了多个干细胞库，一个完善的干细胞库应具备随时随地将储 存的健康干细胞提供临床使用的能力，目前现有技术中构建的脂肪干 细胞库为存储本人、家属和他人在需要采用脂肪成体干细胞移植及相 关技术治疗的各种疾病时，提供临床使用型脂肪成体干细胞，其应用 前景十分广阔，但是现有的脂肪干细胞库配置不够完善，数据存储简 单，无法满足临床研究及日后医用的需求。

发明内容

为了解决现有技术中存在的上述问题，本发明提供了一种人脂肪 干细胞的获取分离培养方法和干细胞库的构建方法。

本发明具体技术方案如下：

本发明提供了一种人脂肪干细胞的获取分离培养方法，该方法包 括以下步骤：

S1、人脂肪组织的采集：在无菌环境下采集供者的脂肪组织，置 于体积比为3-4:1-2的0.9％的氯化钠注射液中清洗干净，去除坏死组织 和结缔组织，将脂肪组织剪成0.5-3.5mm³大小；

S2、人脂肪组织的处理：将脂肪组织收集于离心管中，在1800-2200 rpm/min的条件下离心处理15min，收集上层部分的脂肪层，并用PBS 洗涤；

S3、人脂肪干细胞的消化：加入等体积的消化酶在温度为30-37℃ 的环境下进行20-45min的消化处理，加入等体积的含10％血清的 DMEM完全培养基终止消化，静置20min后，去掉上层，在1200-1500 rpm/min的条件下离心5-8min，弃上清，收集下层的人脂肪干细胞；

S4、人脂肪干细胞的培养：将人脂肪干细胞以2×10⁶细胞/瓶的密 度接种于盛有培养基的培养瓶中，在温度为30-37℃，5％CO₂饱和湿 度的培养箱中培养即完成对人脂肪干细胞的扩大培养。

通过上述方法能够使组织消化更加彻底，同时在细胞培养过程中 能够有效提高干细胞的培养效率，而且能够抑制干细胞分化。

进一步的，步骤S3中，所述消化酶是以D-Hanks平衡盐溶液配制 的混合胶原酶，所述混合胶原酶还包括K脂酶、Ⅰ型胶原酶、Ⅳ型胶 原酶，100mLD-Hanks平衡盐溶液中含有0.1-0.3g K脂酶、0.5-0.8gⅠ 型胶原酶、0.3-0.5gⅣ型胶原酶。通过将K脂酶、Ⅰ型胶原酶和Ⅳ型胶 原酶混合组成的混合胶原酶能够使脂肪组织效果更加彻底，能够明显 降低杂细胞数量，细胞培养中纯度更高。

进一步的，步骤S4中，所述培养基以MEM培养基为基础，其还 包括以下浓度组分：80-150ng/mL的人血清白蛋白、100-200ng/mL的 葡萄糖酸钠、120-180ng/mL的乳糖醛酸。本发明提供的培养基中加入 的人血清白蛋白、葡萄糖酸钠、乳糖醛酸为人脂肪干细胞的培养提供 了充足的营养成分，同时为人脂肪干细胞的培养过程提供了安全的培 养环境，提高了脂肪干细胞的免疫力，有效降低细胞培养过程中的死 亡率。

进一步的，该方法还包括以下步骤：

S5、人脂肪干细胞的冻存：将扩大培养的人脂肪干细胞置于冻存 液中，迅速移入至-80℃的环境下冻存，24小时后，转移至液氮中长期 保存。

大量培养的人脂肪干细胞在扩大培养后通过上述方法进行冻存， 在冻存前需要对细胞进行检测，细胞经过安全检测后进行冻存，为后 期应用提供便利。