[发明专利]基于三维笼型氢氧化铜模拟酶的多组分无标记化学发光成像免疫阵列传感器

权利要求书

1.一种基于三维笼型氢氧化铜模拟酶的多组分无标记化学发光成像免疫阵列传感器，其特征在于，在丝网印刷载玻片的免疫微孔阵列表面成功构建化学发光免疫传感界面，该界面依次包括环氧硅烷化层作为载体连接层；纳米模拟酶-壳聚糖层作为化学发光信号层；链霉亲和素层作为抗体连接层；生物素化抗体层作为免疫反应识别层。

2.根据权利要求1所述的基于三维笼型氢氧化铜模拟酶的多组分无标记化学发光成像免疫阵列传感器，其特征在于，所述免疫微孔阵列是利用丝网印刷技术并借助模板在可抛式的环氧硅烷化载玻片上印刷形成多个微孔的免疫微孔阵列。

3.根据权利要求2所述的基于三维笼型氢氧化铜模拟酶的多组分无标记化学发光成像免疫阵列传感器，其特征在于，所述免疫微孔阵列是利用丝网印刷技术并借助模板在可抛式的环氧硅烷化载玻片上印刷形成4排12列共48个微孔的免疫阵列。

4.根据权利要求1所述的基于三维笼型氢氧化铜模拟酶的多组分无标记化学发光成像免疫阵列传感器，其特征在于，所述三维笼型氢氧化铜纳米粒子的制备方法，其特征包括以下步骤：

（1）将二水合硫化铜（34 mg）、聚乙烯吡咯烷酮K30（261 mg）、无水乙醇（80 mL）依次加入250 mL三口烧瓶，10分钟超声，30分钟搅拌；

（2）15.4 mg硼氢化钠溶入20 mL无水乙醇后在剧烈搅拌条件下快速加入到溶液中，剧烈搅拌72小时；

（3）离心收集并用无水乙醇洗涤干净即得无定型氢氧化铜纳米材料；

（4）取步骤（3）所制备的无定型氢氧化铜纳米材料（9.7 mg）和聚乙烯吡咯烷酮K90（20mg）加入100 mL三口烧瓶中超声30分钟以分散在20 mL蒸馏水中；

（5）铜-氨混合溶液的制备是有5 mL三水合硝酸铜（24.16 mg）水溶液和15 mL氨水（400μL 氨水（29%）和14.6 mL蒸馏水）混合而成，取铜-氨混合溶液（20 mL）在一分钟内加入（4）中分散好的三口烧瓶中并剧烈搅拌10分钟；

（6）通过离心收集产品并依次用丙酮和甲醇洗涤干净即制备得三维笼型氢氧化铜模拟酶。

5.一种制备如权利要求1~4任一所述基于三维笼型氢氧化铜模拟酶的多组分无标记化学发光成像免疫阵列传感器的方法，其特征包括以下步骤：

（1）利用丝网印刷技术并借助模板在环氧硅烷化的载玻片表面制作免疫微孔阵列；

（2）将三维笼型氢氧化铜纳米粒子材料超声分散于去离子水中，再与壳聚糖溶液等体积混合并震荡均匀然后滴入免疫微孔阵列表面，将三维笼型氢氧化铜包埋于阵列中，并在室温下反应直至晾干；

（3）链霉亲和素溶液均匀涂布在上述壳聚糖-氢氧化铜膜表面，放置于3 ℃环境中反应并晾干；

（4）将生物素化抗体特异性结合在链霉亲和素功能化的免疫微孔表面，于室温下密封温育3小时，而后用磷酸盐缓冲溶液冲洗并于氮气氛围中吹干；

（5）将牛血清白蛋白溶液用作封闭液均匀滴涂于步骤（4）中得到的免疫阵列表面，放置于3 ℃下封闭，再用磷酸盐缓冲溶液冲洗后便得到无标记化学发光成像免疫阵列传感器。

6.根据权利要求5所述方法，其特征在于，步骤（1）中，丝网印刷环氧硅烷化载玻片的制备方法：

（1）将载玻片浸泡于水虎鱼酸溶液中，所述水虎鱼酸溶液包括体积比为7:3的H₂SO₄和H₂O₂溶液，去离子水冲洗然后于室温晾干；

（2）将经过（1）处理过的载玻片泡于GPTMS甲苯溶液中，先用甲苯冲洗再用无水乙醇冲洗，然后于室温晾干或是氮气氛围中吹干；

（3）利用丝网印刷技术并借助模板在经过（1）（2）处理好的载波片上印刷4*12格式的环氧硅烷化微孔阵列，微孔直径2 mm，微孔外的绿色部分为具有疏水作用的绝缘油漆。

7.根据权利要求5所述方法，其特征在于，步骤（2）中，三维笼型氢氧化铜纳米粒子浓度为0.5 ~ 2.0 mg/mL，壳聚糖溶液的浓度为0.5 ~ 1.5 wt%。