[发明专利]一种细菌来源几丁质酶、及其在制备GlcNAc中的应用

说明书

本发明公开一种细菌来源几丁质酶BsChi在降解固体几丁质中的应用，编码所述几丁质酶BsChi的基因的核苷酸序列如GenBank(AF069131.1)所示。利用所述几丁质酶BsChi与N‑乙酰葡糖胺酶OfHex1组成复合酶，将两种几丁质降解酶复合使用后，其水解几丁质粗原料生产GlcNAc的效率有了很大提升。经过对该几丁质酶的表达纯化及活性分析后，发现无论是对底物的结合能力还是对复杂底物的水解能力都较一般的几丁质酶有相应的增强。尤其是当二者摩尔比例为(96～99)：(1～4)；酶量达到20μM以上时，水解超微蟹粉、黑曲霉菌丝体和虾皮粉等固体几丁质粗底物时能够产生90％的GlcNAc，具有良好的工业化应用前景。

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种高效的细菌来源几丁质酶的制备方法及与一种昆虫来源的高效N-乙酰葡糖胺酶的联合应用。

背景技术

几丁质(chitin)是以N-乙酰-β-D-葡萄糖胺(GlcNAc)为基本单位在自然界大量存在的天然线性直链多糖。几丁质降解后的多种产物如GlcNAc、(GlcNAc)₂、几丁寡糖等可用于食品、保健品和化妆品的生产，且研究表明GlcNAc及其衍生物在人体免疫系统、癌症研究中起着很重要的作用。自然界中，几丁质主要存在于节肢动物的外骨骼中，如虾壳、蟹壳，但是传统的化学方法处理这些废弃物得到的副产物种类繁多，其分子大小难以控制、去乙酰化程度不一致，并且化学方法会造成严重的环境污染，所以这些废弃物常常得不到充分的利用。

相对于化学方法，利用纯化后的几丁质酶水解几丁质得到的产物比较均一且不会对环境造成污染，是一种应用前景良好的方法。但是就目前的酶法水解而言还存在水解效率低，酶的利用率低等缺点和不足。迫切需要找到高效的几丁质酶来实现几丁质粗底物的工业转化。

发明内容

为了提高利用几丁质粗原料生产GlcNAc的效率，本发明首先分别提供了两种几丁质降解酶，包括：一种高效的细菌来源几丁质酶和一种昆虫来源的高效N-乙酰葡糖胺酶；在此基础上，本发明将所述两个几丁质降解酶进行合理组合使用，发挥了协同作用，在复合酶生产GlcNAc中显示出良好的应用前景。

本发明公开一种细菌来源几丁质酶BsChi在降解固体几丁质中的应用，具体的，编码所述几丁质酶BsChi的基因的核苷酸序列如GenBank(AF069131.1)所示。经过对该几丁质酶的表达纯化及活性分析后，发现无论是对底物的结合能力还是对复杂底物的水解能力都较一般的几丁质酶有相应的增强。

对于上述技术方案中所述的应用，是利用所述几丁质酶BsChi水解固态底物α-几丁质和β-几丁质，例如：含几丁质的生物质，如节肢动物外壳及真菌菌丝体，包括超微蟹粉、黑曲霉菌丝体和虾皮粉等固态底物，几丁质酶BsChi的最适温度为30～50℃，最适pH值为5～7。

对于上述技术方案中所述的应用，具体的，是即利用所述几丁质酶BsChi与N-乙酰葡糖胺酶OfHex1组成复合酶，将两种几丁质降解酶复合使用后，其水解几丁质粗原料生产GlcNAc的效率有了很大提升。其中，编码所述N-乙酰葡糖胺酶OfHex1基因的核苷酸序列如GenBank(DQ887769.1)所示。进一步研究几丁质酶BsChi与N-乙酰葡糖胺酶OfHex1组成的复合酶的协同应用。结果表明，当二者摩尔比例为(96～99)：(1～4)时；尤其是98.5:1.5的比例下，能够产生最大的协同效果，当二者的酶量达到20μM以上时，水解超微蟹粉、黑曲霉菌丝体和虾皮粉等固体几丁质粗底物时能够产生90％的GlcNAc；优选的情况下，二者的酶量达到30μM。

对于上述技术方案中所述的应用，具体的，所述的底物先经预处理，所述的固态底物还经过预处理：粉碎至80～150目后，再经蛋白酶处理；所述蛋白酶的主要成分为枯草杆菌Bacillus licheniformis蛋白酶Carlsberg。

对于上述技术方案中所述的应用，具体的，所述粉碎为超微研磨至100目；所用酶为Alcalase 2.4L FG蛋白酶，用量为1g酶/50g底物。