[发明专利]一种提高葡萄糖氧化酶热稳定性的方法

说明书

本发明公开了一种提高葡萄糖氧化酶热稳定性的方法，属于酶工程领域。本发明的融合酶，是在黑曲霉来源的葡萄糖氧化酶的基础上在其N端融合双亲短肽得到的。本发明的融合葡萄糖氧化酶与初始酶相比，在60℃条件下孵育30min时，其残留酶活是初始酶的10.9倍，融合酶的热稳定性获得了显著的提高。通过本发明的方法，有效提高了葡萄糖氧化酶的热稳定性。

技术领域

本发明涉及一种提高葡萄糖氧化酶热稳定性的方法，属于酶工程领域。

背景技术

葡萄糖氧化酶(glucose oxidase，GOD)是从特异青霉等霉菌和蜂蜜中发现的酶，是同型二聚体结构，每个亚基分为两个不同的结构域：一个区域主要由β-折叠组成，以非共价键与黄素腺嘌呤二核苷酸(FAD)辅酶分子紧密结合；另一个区域则由4个α-螺旋支撑1个反平行的β-折叠组成，可与底物β-D-葡萄糖结合。该酶能将β-D-葡萄糖催化氧化成葡萄糖酸内酯与过氧化氢，其中葡萄糖酸内酯能够在非酶促反应下转化成葡萄糖酸。葡萄糖氧化酶作为工业酶制剂中的重要成员之一，在食品工业、生物传感器和酶生物燃料电池方面都有广泛应用。

近年来，葡萄糖氧化酶作为替代抗生素的新型饲料酶制剂，具有保护动物肠道，促进消化吸收，提高动物机体免疫力等多种功能。葡萄糖氧化酶在饲料应用方面，年需可达30万吨，据估计葡萄糖氧化酶的年总产值在100亿元以上，同时其需求量也以每年10％-30％的速度逐年递增。但饲料在制作过程中通常需要经过造粒，在该过程中会由于瞬间高温而对酶活造成影响。另外，在工业上无论是利用葡萄糖氧化酶进行酶法转化，还是发酵生产葡萄糖氧化酶，罐上温度都得不到及时调控，罐上温度通常维持在40℃-45℃左右。这会造成罐体内的温度通常高于酶发酵的最适温度而造成酶活性的损失。因此，如果可以有效地提高GOD的热稳定性，可以较大程度地降低用于降温的能源消耗从而减少资源浪费。因此，提高葡萄糖氧化酶的热稳定性，在应用和研究中均具有重要的前景和意义。

目前，提高酶热稳定性的方法主要有非理性设计如定向进化、饱和突变等，理性设计如借助计算机辅助设计突变位点进行定点突变等。前者需要建立高效的高通量筛选方法，而后者需要对酶分子结构进行大量的计算机计算，因此快速筛选目标菌株就变得很困难，快速筛选目标菌株就变得很困难。

双亲自组装肽(self-assembling peptides，SAPs)是由相互交替的亲水性和疏水性氨基酸组成，能够聚集形成有序的纳米结构，主要应用于纳米技术领域、细胞培养和分子电子学。其中双亲的特点有利于帮助酶分子与疏水性底物相结合，实现酶分子的定位等。但是，由于不同Linker连接、不同氨基酸长度的双亲短肽对融合酶热稳定性的影响不尽相同，因此双亲自组装肽的添加可能会导致融合酶热稳定性的升高或降低。

发明内容

本发明要解决的问题是提供一种稳定性提高的葡萄糖氧化酶，所述葡萄糖氧化酶为融合表达了双亲短肽的葡萄糖氧化酶。

在本发明的一种实施方式中，所述葡萄糖氧化酶为在N端融合表达了双亲短肽的葡萄糖氧化酶。

在本发明的一种实施方式中，所述双亲短肽的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。

在本发明的一种实施方式中，所述葡萄糖氧化酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.8所示。

一种融合双亲短肽葡萄糖氧化酶表达菌株的构建，所述方法的步骤如下：

(1)将葡萄糖氧化酶的基因与载体连接，扩增双亲短肽；

(2)线性化载体和要插入的短肽的序列利用一步克隆法进行同源重组，得到重组质粒；

(3)将重组后的质粒线性化后转化至宿主细胞。

在本发明的一种实施方式中，所述质粒为pPIC9K。

在本发明的一种实施方式中，所述宿主为毕赤酵母。