[发明专利]一种虹鳟传染性造血器官坏死病毒（IHNV）灭活疫苗的制备方法及其应用

权利要求书

1.一种虹鳟传染性造血器官坏死病毒（IHNV）灭活疫苗的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：

S1. FHM细胞复苏：将冻存的FHM细胞置于35℃-38℃下恒温水浴1-3min，然后再800-1000 r/min 离心4-6 min，去掉上清液，得到复苏的FHM细胞；

S2. FHM细胞基础培养：往S1步骤所得的FHM细胞中加入培养基，然后转移至培养瓶I中培养； 所述培养基中含有体积分数为8%-10%的FBS；

S3. FHM细胞扩大培养：待S2步骤中细胞长满90%-100%，去掉培养液，用D-PBS漂洗2-3次，然后取浓度为0.20%-0.30%的胰蛋白酶消化贴壁细胞，待1-2分钟后去掉胰蛋白酶；然后在细胞液中加入培养基，混匀之后将细胞液转入培养瓶II中，将培养瓶II置于25℃下培养；所述培养瓶II的生长面积是培养瓶I的3-4倍；所述培养基中含有体积分数为8%-10%的FBS；

S4. IHNV病毒培养：待S3步骤中FHM细胞在培养瓶II中长满90%-100%，去掉培养液，用D-PBS漂洗2-3次，然后加入IHNV毒液，13℃-17℃孵育1 h -2h；之后加入培养基维持液，13℃-17℃培养3-4天，收获IHNV病毒；所述培养基中含有体积分数为2%-5%的FBS；

S5. IHNV病毒提纯：将S4步骤得到的IHNV病毒液置于-80℃~-20℃下冻融，然后将病毒液4000~8000r/min离心10~15min，收集上清液得到IHNV活病毒液；

S6. IHNV病毒灭活：往S5步骤中得到的IHNV活病毒液中加入β-丙内酯，直至混合液中β-丙内酯的浓度为0.08-0.1%，静置灭活，然后将灭活后的混合液置于36℃-37.5℃ 恒温水浴2h-2.5h水解β-丙内酯，最后将水解后的混合液经配制得到IHNV病毒灭活疫苗；

其中，所述S1步骤取用的冻存FHM细胞、S2步骤加入的培养基、S3步骤加入的胰蛋白酶、S3步骤加入的培养基、S4步骤加入的培养基维持液的体积比为（1-1.5）：（4-6）：（0.2-1）：（4-6）：（11-13）。

2.根据权利要求1所述的一种虹鳟传染性造血器官坏死病毒（IHNV）灭活疫苗的制备方法，其特征在于：所述S2、S3和S4步骤中所使用的培养基为DMEM培养基，所述培养基在使用过程中加入了青霉素和链霉素，青霉素的工作浓度为95-105U/mL，链霉素的工作浓度为0.08-0.11mg/mL。

3.根据权利要求1所述的一种虹鳟传染性造血器官坏死病毒（IHNV）灭活疫苗的制备方法，其特征在于：所述S4步骤中初始加入的IHNV毒液的滴度为10^5.5 TCID₅₀/mL。

4.根据权利要求1所述的一种虹鳟传染性造血器官坏死病毒（IHNV）灭活疫苗的制备方法，其特征在于：所述的S6步骤中将混合均匀的β-丙内酯和IHNV活病毒液置于3℃-5℃条件下，静置48h-72h灭活。

5.根据权利要求1所述的一种虹鳟传染性造血器官坏死病毒（IHNV）灭活疫苗的制备方法，其特征在于：所述的S6步骤中β-丙内酯和IHNV活病毒液混合后，β-丙内酯的浓度为0.1%。

6.根据权利要求1-5任一项所述制备方法得到的IHNV灭活疫苗在预防传染性造血器官坏死病的应用。