[发明专利]一种生产阿洛酮糖的工程菌株，其构建方法及应用

说明书

本发明公开了一种生产阿洛酮糖重组菌株的构建方法及应用。所述构建方法通过调控葡萄糖胞内代谢，降低谷氨酸棒杆菌中果糖6‑磷酸激酶和葡萄糖6‑磷酸脱氢酶的酶活性，增强葡萄糖激酶和葡萄糖6‑磷酸异构酶酶活性从而提高胞内果糖6‑磷酸的含量，构建由6‑磷酸阿洛酮糖3‑差向异构酶和6‑磷酸阿洛酮糖磷酸化酶组成的阿洛酮糖合成途径，由果糖透过酶和果糖激酶组成的果糖代谢途径，以及由甘油透过酶、甘油脱氢酶和二羟丙酮激酶组成的甘油代谢途径；获得了一株谷氨酸棒杆菌重组菌株，该菌株可以代谢甘油、葡萄糖、果糖或者蔗糖合成阿洛酮糖，与目前报道的生物转化果糖合成阿洛酮糖方法相比，具有转化率高、生产成本低等优点，适合规模化生产阿洛酮糖。

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种生产阿洛酮糖工程菌，该工程菌的制备方法以及将其用于发酵生产阿洛酮糖中的应用。

背景技术

稀少糖(Rare Sugar)是自然界中存在但含量极少的一类单糖及其衍生物(2002年国际稀少糖学会ISRS定义)。近年来，D-阿洛酮糖作为果糖的差向异构体在膳食、保健、医药等领域引起了广泛关注，阿洛酮糖其甜度为蔗糖的70％，然而能量值仅为0.007kcal/g，且能量吸收效率仅为蔗糖的0.3％，是一种非常理想的低卡路里甜味剂，可作为蔗糖替代品应用于食品领域；D-阿洛酮糖被证明具有降血糖的作用，还可以抑制肝脏脂肪合成酶肠道α-糖苷酶的活性，从而减少腹部脂肪的累积，在治疗神经退行性和动脉粥样硬化疾病方面也有很高的医疗价值。美国食品及药品管理局(FDA)于2011年正式批准D-阿洛酮糖为GRAS食品，允许应用到食品、医药制剂以及膳食补充剂中，因此，D-阿洛酮糖具有良好的应用前景和开发价值。

目前生产阿洛酮糖主要通过化学合成和生物转化两种方法，化学合成需要多步保护和脱保护步骤，生产成本高且收率低。生物转化法以果糖为原料，经D-阿洛酮糖3-差向异构酶催化合成D-阿洛酮糖，该方法催化合成效率较高，是目前合成阿洛酮糖的主要方式，然而该方法转化率低，目前最高只能达到32％的转化率，需要添加模拟流动床设备实现果糖循环利用，造成产物不易分离，阿洛酮糖生产成本升高，亟待开发一种低成本，低污染，高产率的阿洛酮糖合成新方法。当细胞代谢葡萄糖、果糖等多种碳源时，可以胞内合成果糖6-磷酸，后者可以经阿洛酮糖6-磷酸差向异构酶催化为阿洛酮糖6-磷酸，再经去磷酸化酶合成阿洛酮糖，该合成路线具有转化率高的优点，因此本发明提出采用基因工程技术和微生物学方法构建微生物工程菌株，再以廉价的葡萄糖、果糖为底物发酵生产阿洛酮糖的新思路。

发明内容

本发明的目的一是提供一种生产阿洛酮糖工程菌株的构建方法。所述构建方法包括以下步骤：

(1)增强葡萄糖激酶和葡萄糖6-磷酸异构酶的酶活性，其特征为通过引入强启动子或者采用质粒表达形式提高葡萄糖激酶和葡萄糖6-磷酸异构酶基因的表达强度，或者采用染色体整合方式整合其他物种来源的酶活性更高的葡萄糖激酶和葡萄糖6-磷酸异构酶基因。

(2)降低果糖6-磷酸激酶和葡萄糖6-磷酸脱氢酶的酶活性，其特征为采用基因敲除或者引入弱启动子方式，降低细胞果糖6-磷酸激酶和葡萄糖6-磷酸脱氢酶基因的表达水平。

(3)增强6-磷酸阿洛酮糖3-差向异构酶和6-磷酸阿洛酮糖磷酸化酶的酶活性，其特征为采用染色体整合或者质粒表达形式，向胞内引入6-磷酸阿洛酮糖3-差向异构酶和6-磷酸阿洛酮糖磷酸化酶基因。

(4)增强果糖透过酶和果糖激酶的酶活性，其特征为采用强启动子、染色体整合或者质粒表达形式，增强果糖透过酶和果糖激酶基因的表达水平。

(5)增强甘油透过酶、甘油脱氢酶和二羟丙酮激酶的酶活性，其特征为采用强启动子、染色体整合或者质粒表达形式，提高甘油透过酶、甘油脱氢酶和二羟丙酮激酶基因的表达水平。