[发明专利]基于荧光共振能量转移的均相荧光检测血清蛋白的方法

说明书

本发明提供了一种基于荧光共振能量转移的均相荧光检测血清蛋白的方法，以荧光染料标记纳米抗体为能量供体，另以相应荧光淬灭剂标记同种纳米抗体或者配对纳米抗体为能量受体；本发明采用纳米抗体，稳定性好，且对血清中的样本检测基本无影响，以荧光染料标记纳米抗体为能量供体，另以相应荧光淬灭剂标记同种纳米抗体或者配对纳米抗体为能量受体，采用双抗体夹心的方法有效解决了免疫分析方法中存在的灵敏度低以及血清样本的氧化还原物质的影响的缺点，保证了方法的快速灵敏。

技术领域

本发明涉及医学检验技术领域，尤其涉及基于荧光共振能量转移的均相荧光检测血清蛋白的方法。

背景技术

免疫分析法是一种微量生物分析方法，它利用抗原抗体间的高亲和性以及作为探针的标记物的高度可测性，能够对生物体内微量物质进行准确的定量分析，具有操作简单、特异性好、灵敏度高等优点，已成为生物学、医学、化学等学科领域研究的重要手段。免疫分析根据其反应系统的物理状态的不同可以分为均相免疫分析和非均相免疫分析。在现有的免疫分析方法中，非均相免疫分析法以RIA、ELISA和CLIA应用最为广泛，但非均相免疫分析需要进行抗原抗体复合物与游离抗原抗体的分离步骤，从而提高信噪比和分析的灵敏度，所以操作相对繁琐。分离抗原抗体复合物与游离抗原抗体是关键，也最容易产生误差。而且由于非均相免疫分析包括了包被(抗原或抗体)、封闭、多次温育、洗涤以及检测等过程，一般需要2小时以上。均相免疫分析因其具有不需要分离抗原抗体复合物与游离抗原抗体即可直接以及均相反应比固相、半固相反应更为简便迅速等特点，成为目前免疫分析方法研究中的重要方向。其中均相荧光免疫分析在抗原抗体特性性反应完成之后，无需将抗原抗体复合物与游离的抗原抗体进行分离，可以直接进行测定，操作简单快捷，易于实现自动化，得到了广泛应用。

荧光共振能量转移(FRET)是一种非辐射的能量转移，其产生需满足以下4 个条件：(1)能量供体的发射光谱与能量受体的激发光谱有效重叠；(2)能量供体的量子产率较高；(3)供体受体间满足一定的耦极取向；(4)供体受体间的距离小于10nm。供体与受体之间发生FRET将会使能量供体的荧光强度降低，受体发射的荧光强度增强，同时伴随它们的荧光寿命的相应缩短和延长。 FRET技术作为一种高效的光学“分子尺”，在于生物大分子相互作用、免疫分析、核酸检测等方面有广泛的应用。FRET属于一种比较简便的均相免疫分析法，由于其操作简单，反应速度较快，越来越引起人们的关注。

而现有的基于荧光共振能量转移(FRET)的均相免疫分析方法检测血清样本，稳定性较差，且血清样本中的物质很复杂，可能含有各种药物或者成分会改变血清的氧化还原条件，对血清中样本的检测有较大的影响,对于直接采用抗体重链和轻链以及待检测抗原的检测方式有较大影响。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术之缺陷，提供了一种基于荧光共振能量转移的均相荧光检测血清蛋白的方法，稳定性好，对血清中的样本的基本无影响。

本发明是这样实现的：

本发明提供一种基于荧光共振能量转移的均相荧光检测血清蛋白的方法，以荧光染料标记纳米抗体为能量供体，另以相应荧光淬灭剂标记同种纳米抗体或者配对纳米抗体为能量受体，具体包括如下步骤：

步骤1、以荧光染料标记待测抗原的纳米抗体；

步骤2、以相应荧光染料淬灭剂标记同种纳米抗体或者配对纳米抗体，所述荧光染料和相应荧光染料淬灭剂为符合FRET特征的试剂对；

步骤3、配制几个已知浓度梯度的待测抗原溶液，将步骤1获得的荧光标记纳米抗体和步骤2中获得的淬灭剂标记抗体与待测抗原溶液在pH6-8的缓冲液中混合均匀，温育30min，得到混合体系；

步骤4、免疫反应完成后，得到所述多个标准抗原溶液的荧光强度，以及荧光强度的猝灭程度与浓度之间的关系，测试血样中未知浓度待测抗原样本的荧光强度，根据所述关系即可得到待测抗原的浓度。