[发明专利]一种减毒单核细胞增生李斯特氏菌及其疫苗

说明书

本发明提供了一种减毒单核细胞增生李斯特氏菌，在敲除李斯特氏菌EGDe毒力基因actA及inlB的基础上，再缺失dal与dat基因。上述的一种减毒单核细胞增生李斯特氏菌的保藏号为CGMCC NO：14611。本发明还提供了上述的减毒单核细胞增生李斯特氏菌作为疫苗的用途。本发明的单增李斯特氏菌的减毒疫苗，由于采用了基因敲除技术对两个毒力基因及两个生长相关基因的敲除，保证了减毒菌株的安全性。实验结果表明，该疫苗具有良好的免疫原性，能引起细胞多种免疫因子产生，并能产生较高的免疫保护效果。

技术领域

本发明属于基因工程领域，涉及一种单增李斯特氏菌，具体来说是一种减毒单核细胞增生李斯特氏菌、及其疫苗。

背景技术

单核细胞增生李斯特氏菌(Listeria monocytogenes，Lm)是一种重要的食源性致病菌，在自然环境中广泛分布。Lm具有较强的生存能力，pH在4.5–9，温度在0-45℃均可增殖，在干酪、原奶、冰淇淋、生肉、海鲜及方便食品，如：熟肉、熏鱼中均有检出。单增李斯特氏菌可穿透肠道屏障、胎盘屏障和血脑屏障，引起哺乳动物和人的肠胃炎、败血症、孕畜流产及脑膜炎等。超过99％的单增李斯特氏菌感染是由于食用了被该菌污染的食物，死亡率达30％以上。单增李斯特氏菌是典型的胞内寄生菌，它可通过李斯特氏菌溶血素、磷脂酰肌醇特异性磷脂酶C和卵磷脂酶的裂解作用下逃离吞噬小体，并在细胞质中增殖。

目前，国内对致病菌的防治方法相对落后，主要依赖大规模使用抗生素，但抗生素的使用导致微生物产生耐药性，并可能使食品存在药物残留。研究发现，金黄色葡萄球菌对红霉素的耐药率达33.3％，副溶血性弧菌对四环素和复方磺胺甲恶唑耐药率分别为2.1％和3.2％，沙门菌对萘啶酸的耐药率为50％。研发高效疫苗，通过免疫途径提高动物自身免疫力，降低抗生素的使用量，是预防致病菌感染的有效途径。

D-丙氨酸(D-Ala)，为细菌细胞壁肽聚糖的重要组成成分。在单核细胞增生李斯特氏菌中，存在两种途径生成D-Ala：基因dal编码丙氨酸消旋酶(Alr)，可将L-Ala转化为D-Ala；基因dat编码D-氨基酸氨基转移酶蛋白，可将D-谷氨酸与丙酮酸通过转氨作用生成D-Ala与α-酮戊二酸，当dal与dat基因全部缺失时，由于不能合成D-Ala，在无外源D-Ala添加时，该dal/dat双基因缺失菌株将发生溶菌死亡。

发明内容

针对现有技术中的上述技术问题，本发明提供了一种减毒单核细胞增生李斯特氏菌、及其疫苗，所述的这种减毒单核细胞增生李斯特氏菌、及其疫苗要解决现有技术中抗生素滥用导致环境污染及食品抗生素残留的问题。

本发明提供了一种减毒单核细胞增生李斯特氏菌，在敲除李斯特氏菌EGDe毒力基因actA及inlB的基础上，再缺失dal与dat基因。

进一步的，上述的一种减毒单核细胞增生李斯特氏菌的保藏号为CGMCC NO：14611。

本发明还提供了上述的减毒单核细胞增生李斯特氏菌作为疫苗的用途。

本发明以单核细胞增生李斯特氏菌野生株EGDe actA及inlB双毒力基因缺失株(EGDeΔactA/inlB)为亲本，利用同源重组的方法进一步构建缺失了基因dal及dat的菌株(EGDeΔactA/inlB/dal/dat，EGDeΔABdd)。实验验证该缺失株在无外源D-丙氨酸添加时，在正常的培养基及环境下不能生长繁殖，需添加外源D-丙氨酸才能生长繁殖。相关细胞及动物实验表明，该缺失菌株具有良好的安全性及免疫原性，可作为一株新型的减毒单增李斯特氏菌疫苗。

本发明提供的单增李斯特氏菌基因actA/inlB/dal/dat的敲除株，是通过单增李斯特氏菌基因敲除载体pKSV7分别敲除actA/inlB/dal/dat四个基因得到。