[发明专利]有机磷降解酶纳米磁珠抗体复合物、ELISA检测试剂盒及其应用

权利要求书

1.一种有机磷降解酶纳米磁珠抗体复合物，其特征在于，通过以下方法制备得到：

(Ⅰ)制备纳米磁珠；

(Ⅱ)制备有机磷降解酶纳米磁珠；

(Ⅲ)将有机磷降解酶纳米磁珠进行氨基化修饰，得到氨基化的有机磷降解酶纳米磁珠；

(Ⅳ)用有机磷通用抗体包被氨基化有机磷降解酶纳米磁珠得到有机磷降解酶纳米磁珠抗体复合物。

2.按照权利要求1所述的有机磷降解酶纳米磁珠抗体复合物，其特征在于，步骤(Ⅰ)中所述制备纳米磁珠的方法包括：

将FeCl₃·6H₂O、FeSO₄·7H₂O、浓盐酸溶解于水中，超声脱氧后滴入NaOH水溶液；在80℃、搅拌、隔绝空气条件下进行反应；反应结束后，利用磁分离器将所得沉淀从反应介质中分离出来，清洗、即得纳米磁珠。

3.按照权利要求1所述的有机磷降解酶纳米磁珠抗体复合物，其特征在于，步骤(Ⅱ)中所述的有机磷降解酶纳米磁珠的制备方法包括：

(1)将有机磷降解酶的表面进行丙烯酰化修饰；(2)表面丙烯酰化修饰的有机磷降解酶与Fe₃O₄纳米磁珠原位聚合得到有机磷降解酶纳米磁珠；

优选的，步骤(1)将有机磷降解酶的表面进行丙烯酰化修饰的方法，包括：

(a)在有机磷降解酶的Tri-HCl缓冲溶液中加入N-丙烯酰氧基琥珀酰亚胺的DMSO溶液，磁力搅拌反应；(b)反应完成后，将反应溶液放入截流分子量为10,000的透析袋中透析除去未反应的试剂；(c)向透析后的产物中依次加入过硫酸氨的去离子水溶液、丙烯酰胺的DMSO溶液、亚甲基双丙烯酰胺的DMSO溶液以及N,N,N',N'-四甲基二乙胺的DMSO溶液，磁力搅拌反应；(d)将反应溶液透析除去未反应的试剂，得到丙烯酰化的有机磷降解酶溶液；

优选的，步骤(2)中所述的将表面丙烯酰化修饰的有机磷降解酶与Fe₃O₄纳米磁珠原位聚合得到有机磷降解酶纳米磁珠的方法，包括：

向表面丙烯酰化修饰的有机磷降解酶溶液中依次加入过硫酸氨的去离子水溶液、丙烯酰胺的DMSO溶液、亚甲基双丙烯酰胺的DMSO溶液以及N,N,N',N'-四甲基二乙胺的DMSO溶液，磁力搅拌反应；将反应溶液透析除去未反应的试剂，得到丙烯酰化的有机磷降解酶纳米磁珠。

4.按照权利要求1所述的有机磷降解酶纳米磁珠抗体复合物，其特征在于，步骤(Ⅲ)中所述有机磷降解酶纳米磁珠进行氨基化修饰的方法包括：

向有机磷降解酶纳米磁珠无水乙醇溶液中加入水后再用无水乙醇稀释，超声振荡后滴加APTES，室温下搅拌反应；反应完毕后，用磁分离器将APTES修饰的有机磷降解酶纳米磁珠从反应介质中分离，并用无水乙醇溶液清洗，得到氨基化的有机磷降解酶纳米磁珠。

5.按照权利要求1所述的有机磷降解酶纳米磁珠抗体复合物，其特征在于，步骤(Ⅳ)中所述的有机磷降解酶纳米磁珠抗体复合物的制备方法包括：

将氨基化有机磷降解酶纳米磁珠的无水乙醇溶液用PBS清洗后用磁分离器弃上清液；加入戊二醛溶液，室温振荡交联，磁分离，弃上清液；用PBS洗涤并弃上清液后将有机磷降解酶通用抗体稀释后包被氨基化有机磷降解酶纳米磁珠，室温下振荡固定；磁分离，用PBS和超纯水分别洗涤，得到有机磷降解酶纳米磁珠抗体复合物。

6.按照权利要求5所述的有机磷降解酶纳米磁珠抗体复合物，其特征在于，所述有机磷降解酶通用抗体稀释的稀释度为1:100-4000，更优选的，所述有机磷降解酶通用抗体稀释的稀释度为1:1000。

7.一种检测有机磷农药残留的ELISA检测试剂盒，包括：酶标板，包被抗原，CBS稀释液，洗涤液、有机磷农药标样，酶标一抗，酶标二抗，底物溶液和终止液；其特征在于，所述的酶标一抗是权利要求1所述的有机磷降解酶纳米磁珠抗体复合物MFA。