[发明专利]用于靶核酸序列检测的多重淬灭荧光探针及方法

说明书

本发明公开了一种检测靶核酸序列的多重淬灭荧光探针及其方法，所述多重淬灭荧光探针具有两个以上淬灭基团。所述检测靶核酸序列的方法是以待检测核酸序列为模板，在相应引物与多重淬灭荧光探针作用下进行荧光PCR反应，绘制熔解曲线。本发明的基于杂交序列荧光淬灭基团切割的靶核酸序列检测方法与其它溶解曲线分析技术相比，当检测靶序列不存在情况下，荧光探针不产生荧光信号，使得熔解曲线分析时的背景本底明显降低，不会影响其它阳性靶序列的检测；当有多条荧光探针存在时，荧光探针自身的本底信号不会互相干扰，使得多重PCR的判读更加清晰。

技术领域

本发明属于基因工程技术领域，更具体地，本发明涉及一种基于杂交序列荧光淬灭基团切割及溶解曲线分析的靶核酸序列检测的多重淬灭荧光探针及检测方法。

背景技术

荧光PCR技术是检测靶核酸序列的常用技术，目前常用的荧光PCR检测方法包括Taqman探针法、分子信标探针法、杂交探针法等。其中Taqman探针法主要依赖核酸聚合酶的外切酶活性，在PCR延伸过程中切割与靶序列杂交的荧光探针，释放其5'端荧光基团，通过5'端荧光基团被释放后引起的荧光值上升检测靶序的存在。分子信标探针法和杂交探针法主要通过探针在特定温度下与靶序列的杂交，造成荧光基团与淬灭基团的空间距离变化所引起的荧光信号强弱变化来检测靶序列的存在。

荧光探针溶解曲线分析技术是基于不对称PCR扩增技术的一种定性检测方法。利用分子信标探针、Fret探针或Taqman探针在不对称PCR反应后进行溶解曲线分析，可因为所结合序列变化所造成的溶解曲线峰值变化，从而分辨不同的靶序列位点。这项技术主要优势在于可以利用不同荧光通道和不同荧光探针溶解峰温度的组合同时检测多个检测位点，而且设计良好的探针可以通过溶解峰的变化分辨不同的突变位点。

目前荧光探针溶解曲线技术在同一荧光通道使用多条荧光探针进行检测时，即使荧光探针未与靶序列结合，探针自身或探针之间在低温条件下互相缠绕误杂交也会产生背景信号，多条荧光探针的背景信号之间互相干扰叠加，造成荧光背景过高，从而影响了溶解曲线的判读。

发明内容

为了克服上述现有技术的缺陷，本发明提供了一种基于杂交序列荧光淬灭基团切割的检测靶核酸序列的多重淬灭荧光探针及检测方法，多条检测探针的背景信号之间不会互相干扰叠加。

为了实现上述发明目的，本发明采取了以下技术方案：

一种检测靶核酸序列的多重淬灭荧光探针(Multiple Quencher FluorescenceProbe,MQFP)，所述多重淬灭荧光探针具有两个以上淬灭基团。

在其中一些实施例中，所述淬灭基团为FAM、ROX、HEX、或Cy5。

在其中一些实施例中，所述荧光基团与3'端的淬灭基团的碱基距离为1-30个。

在其中一些实施例中，所述荧光基团与3'端的淬灭基团的碱基距离为1-6个。

一种检测靶核酸序列的方法，采取上述多重淬灭荧光探针进行检测，包括以下步骤：

以待检测核酸序列为模板，在相应引物与多重淬灭荧光探针作用下进行荧光PCR反应，绘制熔解曲线，即可。

本发明的检测靶核酸序列的多重淬灭荧光探针，包含两个以上的荧光淬灭基团。除5'端第一个淬灭基团以外的淬灭基团会在荧光探针与检测靶序列结合情况下，在引物延伸时被DNA聚合酶的核酸外切酶切除，从而释放出仅包含第一个淬灭基团和荧光基团的荧光检测探针片段，并与体系中游离的检测探针结合产生特定Tm值的熔解曲线，从而对靶序列的存在进行检测。当检测靶序列不存在时，多重淬灭荧光探针的荧光基团会被邻近的第二个及之后的淬灭基团淬灭，不会发出荧光，也不会产生荧光探针背景，从而不会影响多重PCR中其它靶序列的检测。与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：