[发明专利]一种高通量快速检测线粒体基因突变或缺失的方法

权利要求书

1.一种高通量快速检测线粒体基因突变或缺失的方法，该检测方法具体包括如下步骤：

1)按照人全基因组DNA提取试剂盒说明书提取DNA，利用设计的两对mtDNA特异性引物，以提取的线粒体DNA为模板，进行PCR扩增得到线粒体DNA扩增产物1和线粒体DNA扩增产物2，将线粒体DNA扩增产物1和线粒体DNA扩增产物2混合纯化后进行打断反应，使打断后DNA主带大小集中在插入片段大小，然后回收所需大小的目的片段；

2)对打断反应后产物末端进行磷酸化修复，并在加3’端加A碱基即得测序产物；给测序产物加上测序接头后进行琼脂糖凝胶电泳分离纯化，回收目标DNA片段形成DNA文库；

3)将DNA文库中目标DNA片段进行PCR扩增，使用Agilent 2100进行DNA片段大小和浓度的检测，浓度和片段大小符合要求后进行测序，得到测序数据并进行数据分析；

所述的PCR扩增的反应体系包括：PCR为20μl总体系，具体是

2X Phanta Max Buffer 10μl，dNTP mix 1μl，

Phanta Max Super-Fidelity DNA Polymerase 1μl，

10uM的mtDNA 1F或mtDNA 2F 2μl，

10uM的mtDNA 1R或mtDNA 2R 2μl，

ddH₂O 3μl，10-100ng的DNA模板1μl；

其中mtDNA 1F序列为:TCCCCACATCAAGCCCGAATGATATTTC；

mtDNA 1R序列为ATTCCGGATAGGCCGAGAAAGTGTTGT；

mtDNA 2F序列为ATTTCACTATCATATTCATCGGCGTAAAT；

mtDNA 2R序列为GGGACGGATCGGAGAATTGTGTAGGCGAAT；

所述检测是NGS检测，DNA测序通过Illumina HiSeq2000测序。

2.根据权利要求1所述的高通量快速检测线粒体基因突变或缺失的方法，其特征在于，

所述步骤2)中测序产物的制备方法为：取nuclease free离心管，按以下体系加入试剂，End Prep Enzyme Mix，3μL；10X End Repair Reaction Buffer，6.5μL；PCR产物，55.5μL；移液器吹打混匀，然后按照以下PCR循环条件进行反应：20℃，30s；65℃，30s；4℃，Forever。

3.根据权利要求1所述的高通量快速检测线粒体基因突变或缺失的方法，其特征在于，

所述步骤1)中人全基因组DNA提取方法为：

1)取适量组织在液氮环境中充分研磨后再转移至1.5mL离心管，加入1mL Trizol，立即充分混匀；将混匀的组织在室温放置10min，使充分裂解；加入200μL氯仿，充分震荡混匀，4℃离心，12000rpm 10min；

2)取上层水相，加入等体积的酚:氯仿＝25:24，充分混匀，4℃离心，12000rpm 10min；取上层水相，加入等体积氯仿，充分混匀，4℃离心，12000rpm 10min；取上层水相，加入等体积异丙醇，‐20℃静置1小时，4℃离心，12000rpm 10min；

3)弃上清，加入1mL75％乙醇，洗涤沉淀，4℃离心，8000rpm 5min，弃上清，重复操作1次；短暂离心，移液器吸干乙醇，真空干燥2‐4min；加20‐50μL RNase‐Free Water，室温溶解10min，混匀后瞬时离心；‐80℃保存。

4.根据权利要求1所述的高通量快速检测线粒体基因突变或缺失的方法，其特征在于，所述插入片段的大小为300‐500bp。

5.根据权利要求1所述的高通量快速检测线粒体基因突变或缺失的方法，其特征在于，所述步骤2)中测序产物加测序接头的操作中将测序产物25μ l 、DNA Adapter 2.5μ l 、PEG6000 5μ l 和T4DNA Ligase 2.5μ l 混合。