[发明专利]一种高亲和性结合I型胶原蛋白的GST融合蛋白制备及其应用

说明书

本发明公开了一种高亲和性结合I型胶原蛋白的GST融合蛋白制备及其应用。所述蛋白在GST的C‑端带有可与I型胶原蛋白高亲和性结合的PlGF‑2_‑123‑144短肽。在ELISA检测中显示出对Ⅰ型胶原蛋白的高亲和性；该融合蛋白可赋予C‑端连接的短肽对Ⅰ型胶原蛋白的高亲和性。该蛋白特异性强、分子量小、易于制备，可用于改造多种抗纤维化药物、以提高其在纤维化部位的富集和滞留、从而延长其作用时间。

技术领域

本发明属生物医学工程技术领域，尤其涉及一种高亲和性结合I型胶原蛋白的GST融合蛋白制备及其应用。

背景技术

纤维化疾病几乎涉及临床各科，包括系统性硬化、特发性肺纤维化、肝硬化、进展性肾病、骨髓纤维化等，已严重威胁人们健康。其主要特征是细胞外基质蛋白(ECM)尤其是Ⅰ型胶原蛋白的过度沉积。目前各类纤维化疾病中以肝纤维化、肺纤维化和肾纤维化患病者多且不易治疗，最后病情发展危机病人生命，尤其肺纤维化因其特殊的结构药物在病灶难进入、难滞留更成为各类纤维化疾病中尤为难以治疗的疾病。目前已有各类尝试：TGFβ抗体、TGFβ拮抗剂、秋水仙碱、紫杉醇等都显示出了一定的治疗效果，IFN-γ因具有调节巨噬细胞和成纤维细胞功能而成为抑制纤维化的有力候选药物。但因药物缺乏靶向性，在病变部位滞留时间短，使得疗效并不理想。人体受伤后通常会自我修复受损组织，这一过程是由一种被称为生长因子的蛋白质所控制的。细胞内的生长因子可以加速伤口愈合，避免失血过多及并发症，对胚胎发育也很重要。生长因子则是通过聚合一种名为“细胞外基质(ECM)”的蛋白质来促进机体组织细胞的生长。细胞外基质好比机体组织的“框架”，通常情况下，生长因子聚合细胞外基质的能力越强，伤口愈合得越快。2017年，洛桑联邦工学院教授杰弗里·哈贝尔领导的研究小组对25种生长因子进行了动物实验，结果发现，“PIGF-2”生长因子对细胞外基质的聚合能力最强，促进组织器官修复的效率最高。本发明则根据目前存在的问题与最新研究，发现可以高亲和结合ECM蛋白的人胎盘生长因子2中氨基酸123-144结构域(PlGF-2_123-144)，经过大量的软件设计，成功设计了可在原核细菌中高表达、细菌裂解后大量存在于上清的GST融合蛋白的基因序列，尤其是摸索出能高效表达和纯化这种可溶蛋白的实验条件。进一步地，经过文献调研，发现双环β血小板衍生生长因子受体识别肽(BiPPB)可特异性地识别β血小板衍生生长因子受体,于是将该多肽连接于GST融合蛋白的C-端，并检测融合蛋白用于改造其他蛋白、多肽等的可行性。经实验证明当PlGF-2_123-144短肽C-端连接其他短肽(BiPPB)后，仍然保持对I型胶原蛋白高亲性。期望所述融合蛋白可用于改造抗纤维化药物以提高其在纤维化部位的富集和滞留，从而延长药物作用时间，提高药物疗效。

发明内容

本发明的目的是提供一种对细胞外基质ECM尤其是I型胶原蛋白(CollagenⅠ)具有高亲和结合的GST融合蛋白，包括编码高亲和结合I型胶原蛋白的GST融合蛋白的PlGF-2_123-144的DNA序列；本发明的另一个目的是提供一种高亲和结合I型胶原蛋白的GST融合蛋白的制备方法及其应用。

实现本发明目的之技术方案如下：一种高亲和性结合I型胶原蛋白的GST融合蛋白，其氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示。所述的GST融合蛋白的基因表达序列，其基因序列如SEQ ID NO：2所示。

进一步的所述的GST融合蛋白，所述融合蛋白在GST的C-端带有人胎盘生长因子2短肽片段PlGF-2_123-144，以介导融合蛋白和I型胶原蛋白高亲和性结合。

进一步的所述的GST融合蛋白，所述的带有PlGF-2_123-144短肽的融合蛋白是指GST-PlGF-2_123-144重组质粒经过最适诱导表达、纯化条件后获得。

进一步的上述的GST融合蛋白，所说的最适诱导表达条件是为IPTG至终浓度1mM，30℃，6h。