[发明专利]一种高效的hPSCs向MSCs分化的方法

权利要求书

1.一种高效的hPSCs向MSCs分化诱导的方法，其步骤是：

1）将未分化hPSCs细胞株转移到细胞外基质包被的培养板上培养后；换用含有BMP-SMAD1/5/8信号通路激活剂、TGF-β1/ Activin/ Nodal-SMAD2/3信号通路激活剂、Wnt激活剂和PI3K抑制剂的分化培养基培养；获得中段原条；

2）去除旧培养基，换含有TGF-β1/ Activin/ Nodal-SMAD2/3信号通路抑制剂分化培养基继续培养；

3）将细胞消化并转移到新的培养板上，换含有TGF-β1/ Activin/ Nodal-SMAD2/3信号通路抑制剂分化培养基继续培养；

4）将细胞消化并转移到贴壁用培养板上继续培养，获得MSCs；

上述获得的MSCs是使用诱导hPSCs通过中段原条阶段向MSCs定向分化的方法来获得的。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤3）中，新的培养板是用明胶类细胞外基质包被的，进行细胞筛选。

3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，明胶类细胞外基质为细胞培养用明胶或I型、III型、IV型、V型胶原蛋白和弹性蛋白以及层粘连蛋白。

4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤1）中，用含有BMP-SMAD1/5/8信号通路激活剂、TGF-β1/ Activin/ Nodal-SMAD2/3 信号通路激活剂、Wnt激活剂和PI3K抑制剂的分化培养基培养时间为12~72h。

5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤1）中，BMP-SMAD1/5/8信号通路激活剂BMP2、BMP4、BMP7中的至少一种。

6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤1）中，TGF-β1/Activin/ Nodal-SMAD2/3 信号通路激活剂为Activin A、Activin B、TGF-β1、Nodal中的至少一种。

7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤1）中， Wnt激活剂为CHIR99021，BIO、WNT-3a、R-spondin-2中的至少一种。

8.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤1）中， PI3K抑制剂为TG100713、PIK90、PI-103中的至少一种。

9.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，TGF-β1/Activin/Nodal-SMAD2/3信号通路抑制剂为SB431542、SB505124、A8301、RepSox中的至少一种。

10.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤3）中，继续培养的时间为2～30天。

11.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，在步骤2）继续培养之前，先用含有BMP-SMAD1/5/8信号通路激活剂、TGF-β1/ Activin/ Nodal-SMAD2/3信号通路激活剂和Wnt抑制剂的分化培养基培养。

12.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，在步骤2）中，继续培养的时间为2~10天。

13.根据权利要求11所述的方法，其特征在于，Wnt抑制剂为Wnt-C59、XAV-939中的至少一种。

14.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤4）中继续培养的方法是：用含有间充质干细胞培养基培养。

15.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，在步骤1)至步骤4）中，至少一种培养基中含有碱性成纤维细胞生长因子bFGF。