[发明专利]一种热稳定DNA扩增融合酶

权利要求书

1.一种热稳定DNA扩增融合酶，其特征在于：它采用如下步骤制备：

步骤一：采用全基因合成的重叠PCR延伸方法，利用高保真酶合成SEQ NO.1和SEQ NO.2所显示的核苷酸序列，将两部分所显示的核苷酸序列，通过GGTACTGGTACTGGTGGT所组成的连接序列相连接；

步骤二：再将以上所述两部分核苷酸序列和连接序列通过引物重叠PCR连接起来的过程中，对全长片段进行连接时，在上下游引物的两端分别加上EcoRI和SalI两个限制性内切酶的识别和酶切位点，同时在下游引物上加上终止密码；全长扩增后，得到SEQ NO.3所示全长序列，经过双酶切连接到pET28a(+)载体的相应位点，转化大肠杆菌DH5alpha,在500μl的培养基中，37℃培养0.5小时，涂布于含有筛选抗生素卡那霉素的LB固体平板上，37℃过夜培养24小时，挑选单菌落，提取重组质粒，进行双酶切和测序鉴定，选择含有正确重组质粒的菌落进行保存；

步骤三：然后将正确的重组质粒转化到制备的高效感受态大肠杆菌表达菌株BL21中，在500μl的培养基中，37℃培养0.5小时，涂布于含有筛选抗生素卡那霉素的LB固体平板上，37℃过夜培养24小时，挑选单菌落，保存待用；

步骤四：挑选基因工程菌单菌落于含有终浓度为50μg/ml卡那霉素的100ml液体LB培养基中，37℃过夜培养；第二天在100ml的培养瓶中加入含有终浓度为50μg/ml卡那霉素的50ml液体LB培养基，将含有过夜培养基因工程菌的菌液按照1:20的比例加入，37℃培养4小时，待OD600达到0.8时，加入IPTG诱导剂，在37℃诱导培养5小时；

5000rpm、10分钟、4℃离心收集和洗涤菌体，重悬于缓冲溶液中，在冰上用超声法破碎细胞，功率100瓦、间隔5秒、30个循环、循环三次，再4℃、12000rpm离心20分钟，取上清，-20℃冻存；按照胶厚度0.75cm，浓缩胶5％，80V电泳，10％分离胶，120V电泳，进行SDS-PAGE电泳；电泳得到的目的片段的大小为108KD，与SEQ NO.3所显示的融合酶基因编码的蛋白大小基本一致；

步骤五：进行2L级别的发酵培养,诱导和纯化；采用XZ-8M型大容量低温高速离心机,5000rpm,5分钟,4℃离心去菌液，收集菌体；再重悬于100ml50mM NaH₂P0₄,500mM KCl,10mMImidazole pH8.0缓冲液中,震荡离心4℃离心收集菌体,以去除LB液体培养基残留；将沉淀后菌泥重悬于50mM NaH₂P0₄,500mM KCl,10mM Imidazole pH8.0缓冲液中，在上述重悬中加入终浓度为2mM DTT、1mM PMSF和0.5mM EDTA,采用HN92-II超声破碎仪,Q6号变辐杆,冰浴、功率400瓦、超声4s、间息5s,30个循环、循环五次,再4℃、10000rpm离心40分钟,取上清,采用0.45μm过滤器过滤除颗粒,-20℃冻存待用；然后再采用APPS MV 50D蛋白纯化仪器对过滤后的上清进行纯化，100ml上样，用溶液50mM NaH₂P0₄,500mM KC1,20mM Imidazole,2mMDTT pH8.0洗涤到基线，NI-NTA 10ml预装亲和柱咪唑梯度洗脱；Sephdex G-25脱盐柱脱盐；SP阳离子柱离子梯洗脱；Superdex 200分子筛柱分离；50ml的50KD超滤管浓缩,再加入终浓度为50％的甘油、0.5％Tween-20、0.5％NP-40和200μg/ml BSA，得到6ml融合酶蛋白。