[发明专利]硝呋太尔制霉素阴道软胶囊的微生物限度检查方法

权利要求书

1.一种硝呋太尔制霉素阴道软胶囊的微生物限度检查方法，其特征在于步骤如下：

(1)菌液制备

分别制备金黄色葡萄球菌菌悬液、铜绿假单胞菌菌悬液、枯草芽孢杆菌菌悬液、白色念珠菌菌悬液和黑曲霉孢子悬液；

(2)供试液制备

称取硝呋太尔制霉素阴道软胶囊供试品10g，用无菌剪刀剪碎置于无菌均质袋中，加80ml的43℃无菌十四烷酸异丙酯，用均质器拍打1min，倒入无菌三角瓶中，胶囊壳留在无菌均质袋中加入50ml的43℃pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液用手把胶囊壳揉碎，再倒入三角瓶中震摇后，加入43℃pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液350ml震摇静置5分钟，用无菌注射器吸取上层十四烷酸异丙酯和供试品混合的溶液弃去，再用无菌注射器加无菌溶出仪针取水层240-260ml移入无菌三角瓶中，作为1：40的供试液；

(3)需氧菌、霉菌和酵母菌总数的测定

①试验组：取1:40供试液1ml，置43℃含3％聚山梨酯80和0.3％大豆卵磷脂的pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液500ml中，经薄膜过滤法处理，在最后一次过滤时分别加入金黄色葡萄球菌菌悬液、铜绿假单胞菌菌悬液、枯草芽孢杆菌菌悬液、白色念珠菌菌悬液和黑曲霉孢子悬液，取下滤膜贴于胰酪大豆胨琼脂培养基上置30-35℃培养箱中培养3天；另外再将分别加入白色念珠菌菌悬液和黑曲霉孢子悬液的滤膜贴于沙氏葡萄糖琼脂培养基上置20-25℃培养箱中培养5天；

②菌液组：取pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液代替供试液，按试验组操作加入菌液，测定所加的菌液的菌数；

③供试品组：取制备好的供试液，以pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液代替菌液，其他同试验组操作；胰酪大豆胨琼脂培养基上置30-35℃培养箱中培养5天；沙氏葡萄糖琼脂培养基上置20-25℃培养箱中培养7天；

④培养后进行需氧菌、霉菌和酵母菌总数的测定，

试验组菌落数减去供试品组菌落数的值与菌液组菌落数的比值在0.5～2范围内即为合格；

(4)控制菌的检查

①金黄色葡萄球菌的检查

供试品组：取1：40供试液40ml加入到43℃含3％聚山梨酯80和0.3％大豆卵磷脂的pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液500ml中，用薄膜过滤器全部过滤，加入100mlTSB培养基，混匀，30～35℃培养18～24小时，得到培养物；取上述培养物划线接种于甘露醇氯化钠琼脂培养基平板上，30～35℃培养18～72小时；若平板上没有菌落或鉴定结果为阴性，判定供试品未检出金黄色葡萄球菌；

阳性对照组：取1：40供试液40ml加入到43℃含3％聚山梨酯80和0.3％大豆卵磷脂的pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液500ml中，用薄膜过滤器全部过滤加入100mlTSB培养基，加入金黄色葡萄球菌混匀，30～35℃培养18～24小时，得到培养物；取上述培养物划线接种于甘露醇氯化钠琼脂培养基平板上，30～35℃培养18～72小时；若平板上没有菌落或鉴定结果为阴性，判定阳性对照组未检出金黄色葡萄球菌；

阴性对照组：取pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液40ml加入到43℃含3％聚山梨酯80和0.3％大豆卵磷脂的pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液500ml中，用薄膜过滤器全部过滤，加入100mlTSB培养基，混匀，30～35℃培养18～24小时，得到培养物；取上述培养物划线接种于甘露醇氯化钠琼脂培养基平板上，30～35℃培养18～72小时；若平板上没有菌落或鉴定结果为阴性，判定阴性对照组未检出金黄色葡萄球菌；

②铜绿假单胞菌的检查

供试品组：取1：40供试液40ml加入到43℃含3％聚山梨酯80和0.3％大豆卵磷脂的pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液500ml中，用薄膜过滤器全部过滤，加入100mlTSB培养基，混匀，30～35℃培养18～24小时，得到培养物；取上述培养物划线接种于溴化十六烷基三甲铵琼脂培养基平板上，30～35℃培养18～72小时；若平板上没有菌落或鉴定结果为阴性，判定供试品未检出铜绿假单胞菌；

阳性对照组：取1：40供试液40ml加入到43℃含3％聚山梨酯80和0.3％大豆卵磷脂的pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液500ml中，用薄膜过滤器全部过滤，加入100mlTSB培养基中，加入铜绿假单胞菌混匀，30～35℃培养18～24小时，得到培养物；取上述培养物划线接种于溴化十六烷基三甲铵琼脂培养基平板上，30～35℃培养18～72小时；若平板上没有菌落或鉴定结果为阴性，判定阳性对照组未检出铜绿假单胞菌；

阴性对照组：取pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液40ml加入到43℃含3％聚山梨酯80和0.3％大豆卵磷脂的pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液500ml中，用薄膜过滤器全部过滤，加入100mlTSB培养基中，混匀，30～35℃培养18～24小时，得到培养物；取上述培养物划线接种于溴化十六烷基三甲铵琼脂培养基平板上，30～35℃培养18～72小时；若平板上没有菌落或鉴定结果为阴性，判定阴性对照组未检出铜绿假单胞菌；

③白色念珠菌的检查

供试品组：取供试液40ml加入到43℃含3％聚山梨酯80和0.3％大豆卵磷脂的pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液500ml中，用薄膜过滤器全部过滤，加入500ml沙氏葡萄糖液体培养基中，混匀，30～35℃培养3～5天，得到培养物；取上述培养物划线接种于沙氏葡萄糖琼脂培养基平板上，30～35℃培养24～48小时；若平板上没有菌落或鉴定结果为阴性，判定供试品未检出白色念珠菌；

阳性对照组：取供试液40ml加入到43℃含3％聚山梨酯80和0.3％大豆卵磷脂的pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液500ml中，用薄膜过滤器全部过滤，加入500ml沙氏葡萄糖液体培养基中，加入白色念珠菌混匀，30～35℃培养3～5天，得到培养物；取上述培养物划线接种于沙氏葡萄糖琼脂培养基平板上，30～35℃培养24～48小时；若平板上没有菌落或鉴定结果为阴性，判定阳性对照组未检出白色念珠菌；

阴性对照组：取pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液40ml加入到43℃含3％聚山梨酯80和0.3％大豆卵磷脂的pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液500ml中，用薄膜过滤器全部过滤，加入500ml沙氏葡萄糖液体培养基中，混匀，30～35℃培养3～5天，得到培养物；取上述培养物划线接种于沙氏葡萄糖琼脂培养基平板上，30～35℃培养24～48小时；若平板上没有菌落或鉴定结果为阴性，判定阴性对照组未检出白色念珠菌。