[发明专利]一种沉默T1蛋白的重组病毒及其构建方法与应用

权利要求书

1.一种沉默T1蛋白的重组病毒的构建方法，包括以下步骤：

(1)根据T1的mRNA设计并合成shRNA序列，其中shRNA的上游核苷酸序列mT1-shRNA-F如SEQ ID NO.1所示，shRNA的下游核苷酸序列mT1-shRNA-R如SEQ ID NO.2所示；

(2)将步骤(1)中mT1-shRNA-F和mT1-shRNA-R经退火处理，得mT1-shRNA退火产物；

(3)限制性内切酶BamHI和HindⅢ酶切质粒载体pAAV-ZsGreen-shRNA，纯化回收6000bp大片段得pAAV-ZsGreen酶切产物；

(4)将步骤(2)的mT1-shRNA退火产物与步骤(3)的pAAV-ZsGreen酶切产物连接，连接产物转化感受态细胞，筛选鉴定阳性克隆，抽提阳性质粒pAAV-ZsGreen-shRNA-T1；

(5)复苏293AAV细胞，将步骤(4)的阳性质粒pAAV-ZsGreen-shRNA-T1和辅助质粒pAAV9、pHelper共同转染复苏的293AAV细胞，转染后收集上清，浓缩纯化，获得沉默T1蛋白的重组病毒；

其中，所述T1蛋白是体内神经酪氨酸激酶受体2(NTRK2)基因的截短表达形式，是脑源性神经营养因子的另一种受体，所述T1的mRNA在NCBI的登录号为NM_008745。

2.如权利要求1所述的构建方法，其特征在于，步骤(1)中shRNA序列的5’端引入一个BamHI酶切位点，3’端引入一个HindⅢ酶切位点。

3.如权利要求1所述的构建方法，其特征在于，步骤(3)中的酶切体系为：质粒载体pAAV-ZsGreen-shRNA 2.5μg，10×Buffer 5μL，10×BSA 5μL，HindⅢ 2.5μL，BamH Ⅰ 2.5μL，ddH₂O补足至50μL，反应条件：37℃水浴反应2h。

4.如权利要求1所述的构建方法，其特征在于，步骤(4)中连接时mT1-shRNA退火产物与pAAV-ZsGreen酶切产物的质量比为1:1000。

5.如权利要求1所述的构建方法，其特征在于，步骤(4)中的连接体系为：pAAV-ZsGreen酶切产物2μL，mT1-shRNA退火产物2μL，10×DNA Ligase Buffer 2μL，T4 DNA Ligase 2μL，ddH₂O补足至20μL，反应条件：37℃水浴反应过夜。

6.如权利要求1所述的构建方法，其特征在于，步骤(5)中阳性质粒pAAV-ZsGreen-shRNA-T1、辅助质粒pAAV9、辅助质粒pHelper的质量比为1:1:1。

7.如权利要求1所述的构建方法，其特征在于，步骤(5)中293AAV细胞的复苏包括以下步骤：将293AAV细胞在含有10％胎牛血清的DMEM培养基中培养，待细胞生长成均匀单层细胞并达95％以上聚集度时传代，传代2次后再行转染；用胰酶消化收集细胞，以完全培养基稀释细胞至1～5×10⁶个/ml，接种8～10mL细胞稀释液至10cm培养皿，培养箱中孵育10～15h，转染前1h换液，得复苏的293AAV细胞。

8.如权利要求1所述的构建方法，其特征在于，步骤(5)中293AAV细胞的转染包括以下步骤：应用HET Kit转染293AAV细胞，转染5～7h后换液，换液46～50h后，用吸管将细胞从培养皿中吹下来收集到离心管中，置于-80℃和37℃水浴锅中反复冻融三次，3000～4000rpm离心10～15min，收集上清。

9.根据权利要求1所述的方法所构建的沉默T1蛋白的重组病毒。

10.权利要求9所述的沉默T1蛋白的重组病毒在制备改善内皮功能和减缓动脉粥样硬化的基因药物中的应用。