[发明专利]一种检测阿米巴的PCR引物及方法

说明书

本发明公开了一种检测阿米巴的PCR引物及方法。该PCR引物包括amb‑F:CGGACGGCTCATTATAACAGT，amb‑R:TCCCGTTATTTTCTGAATCACC。其扩增片段为16S rRNA，扩增长度为790bp。检测方法包括(1)提取待检样品的DNA；(2)对待检样品进行PCR扩增反应；(3)对PCR扩增产物进行电泳检测。本发明的方法具有检测快速，特异性强等优点，为简便、快速地检测阿米巴原虫带来便利。

技术领域

本发明涉及微生物检测技术领域，具体说是涉及一种检测阿米巴原虫的PCR引物组及方法。

背景技术

阿米巴原虫病主要是由溶组织内阿米巴(Entamoeba histolytica)引起的一种高发病率、高度致病性的人兽共患寄生性原虫病。该原虫多寄生于人和动物的肠道和肝脏，引发阿米巴痢疾或肝脓肿。临床上表现发热、腹痛腹胀、呕吐、恶臭痢疾血便等症状，病理剖解多见肠炎、肠道出血水肿、溃疡、增生等，个别病例肝脏上出现脓肿。阿米巴原虫病分布范围广泛，易感动物较多，呈世界性流行传播。自1875年Feder Lo sch首次在人体发现该原虫以来，该病已给人和动物的健康带来了严重的影响，同时也造成了巨大的经济损失。比如食蟹猴等动物被阿米巴原虫感染，不仅给养殖业带来经济损失，还严重影响动物质量和动物跟踪研究检测结果的准确性，同时威胁动物饲养人员、兽医工作者及相关密切接触人群身体健康，因此快速的检测出阿米巴原虫感染情况，及时控制清除病原，保持动物的清洁，具有重要的公共卫生意义和研究意义。

溶组织内阿米巴以滋养体和包囊两种存在形式。滋养体大小为7um～60um，形态多变，其胞质分内外两层，内质较浓密呈颗粒状，外质透明，运动时外质伸出，形成伪足，能做定向运动，细胞核呈泡状，核膜薄，核仁细小，居中或偏离中心。包囊多呈球形,直径为10um～16um，未染色时为一折光性圆形小体，碘染色后呈黄色，外周包围一层透明的囊壁，内含1个～4个核,每个核具有1个位于中央的核仁。未成熟包囊，有1个～2个核，常见含有染成棕色的糖原泡和透明的杆状拟染色体；成熟包囊具有4个核，糖原泡和拟染色体不易见到。目前用于实验动物原虫检测还是采用粪便涂片或沉淀染色法等传统检测手段，如GB/T18448.9,GB/T 18448.10，这些方法虽然要求设备仪器不高，但由于原虫体积较小，常常受杂质影响较大，显微镜检查时检出率较低；染色法需要配制试剂种类多，步骤繁琐，要求显微镜操作者非常熟悉各类原虫及卵囊形态，具有超强辨别能力和较好的视力，否则受人为因素影响较大。对于大批量的样品检测，需要大量的人力物力，特别是显微镜观察者眼睛极易疲劳，难以在短时间内完成大量检测样品的工作。

因此利用现代新的分子生物学知识和新仪器设备研究开发新的快速检测原虫病方法，制定出操作规程或标准，非常迫切。

发明内容

本发明的目的是提供一种检测阿米巴的PCR引物及方法，能够更为简便、快捷的检测阿米巴原虫，而且该方法的特异性强、灵敏性高、对模板的纯度要求不高，适用性好。

一种检测阿米巴的PCR引物为：

amb-F:CGGACGGCTCATTATAACAGT，

amb-R:TCCCGTTATTTTCTGAATCACC。

本发明的引物是基于溶组织内阿米巴序列设计的，其扩增片段为16S rRNA，扩增完之后长度为790bp。

本发明的检测阿米巴的非疾病诊断目的的方法采用本发明的PCR引物来检测阿米巴原虫，具体检测过程包括如下步骤：

(1)提取待检样品的DNA；

(2)对待检样品进行PCR扩增反应；先建立PCR反应体系，以每25μL体积为计：