[发明专利]可分离的核酸、多肽、重组载体、重组细胞及应用

说明书

本发明涉及基因工程领域，具体涉及一种可分离的核酸、多肽、重组载体、重组细胞及其应用。所述核酸中包含有CD64序列SEQ ID NO:1、CD86序列SEQ ID NO:2、CD137L序列SEQ ID NO:3和CD256序列SEQ ID NO:4，所述CD64序列、CD86序列、CD137L序列和CD256序列任意相连。根据该核酸得到了该核酸编码的多肽，含有该核酸的重组载体，含有重组载体的重组细胞以及在制药中的应用。本发明通过提供一种分离的核酸序列，用于T细胞的体外的大量扩增，可以大大降低扩增的成本，从而应用在CAR‑T治疗中。

技术领域

本发明涉及基因工程领域，具体设计一种可分离的核酸、多肽、重组载体、重组细胞及其应用。

背景技术

T淋巴细胞是肿瘤细胞的天敌，在肿瘤免疫应答中起主要作用，对肿瘤细胞有极强的杀伤作用。但是，使用内源性T细胞进行肿瘤免疫治疗时，靶抗原需经过加工处理后才能和靶细胞表面的主要组织相容性复合物(main histocompatibility complex，MHC)作用，也即“MHC限制性”。然而，肿瘤免疫编辑的过程会使MHC在肿瘤细胞表面表达下降，破坏抗原加工过程，降低肽段免疫原性。这样长期形成的免疫逃逸机制，能使肿瘤细胞成功躲避T细胞攻击，肿瘤快速增殖。此外，人体内肿瘤特异性的T细胞数量较少，并且由于大多数肿瘤细胞不断表达自体抗原，使得靶向这些抗原的T细胞通过免疫耐受机制被中和或移除，数量进一步减少。因此，包括细胞因子诱导的杀伤细胞在内的T细胞过继性免疫治疗虽然在部分肿瘤的治疗中取得了一定的效果，但在大多数肿瘤中疗效尚不能令人满意。

CAR-T(Chimeric Antigen Receptor T-Cell Immunotherapy)，即嵌合抗原受体T细胞免疫疗法。通过将识别肿瘤相关抗原(tumor-associated antigen，TAA，是指一些肿瘤细胞表面糖蛋白或糖脂成分，它们在正常细胞上有微量表达，但在肿瘤细胞表达明显增高)的scFv和胞内信号域“免疫受体酪氨酸活化基序(immuno-receptor tyrosine-basedactivation motifs，ITAM，通常为CD3ζ或FcεRIγ)”在体外扩增后CAR-T细胞回输到患者体内，CAR-R细胞会在患者体内增殖，可以特异性地识别肿瘤相关抗原，使效应T细胞的靶向性、杀伤活性和持久性较常规应用的免疫细胞大幅提高，并可克服肿瘤局部免疫抑制微环境，从而打破宿主免疫耐受状态，杀灭肿瘤细胞。

尽管CAR-T治疗具有广泛的应用前景，但CAR-T本身是一个个性化和定制化的治疗过程，成本高，制备周期较长，而短时间内无法扩增大量的T淋巴细胞，不仅使得制备成本加大，还会影响回输，耽误病人的病情。所以，如何低成本纯化和大量扩增T细胞成为CAR-T治疗需要解决的首要问题。

发明内容

本发明旨在至少在一定程度上解决相关技术中的技术问题之一。本发明通过将特定的白细胞抗原分子进行基因重组，生成重组质粒，再在体外通过转染技术转染到患者的T细胞，使患者T细胞表达肿瘤抗原受体。转染后经过纯化和大规模扩增后的T细胞，也即CAR-T细胞，可以特异性地识别肿瘤相关抗原，使效应T细胞的靶向性、杀伤活性和持久性较常规应用的免疫细胞大幅提高，并可克服肿瘤局部免疫抑制微环境，从而打破宿主免疫耐受状态，杀灭肿瘤细胞。

具体而言，本发明利用改造后的APC细胞刺激T淋巴细胞，使得T淋巴细胞快速增殖。与目前常用的免疫磁珠扩增的方法相比，不仅扩增效率大大提高，扩增所需要的成本也下降。

本发明旨在通过将含有的T细胞激活所需的共刺激细胞CD28的配体CD80或者CD86，共刺激分子CD137的配体质粒转染到K562细胞，使得改造后的K562细胞表达能够刺激T细胞增殖的相关配体，较短时间内获得大量T细胞，缩短制备周期，从而降低制备成本。

本申请是基于发明人对以下事实和问题的发现和认识作出的：