[发明专利]含CD3启动子序列和CAR序列的可分离的核酸及应用

说明书

本发明涉及基因工程领域，具体涉及一种含CD3启动子序列和CAR序列的可分离的核酸及应用。所述核酸中具有CD3启动子序列和CAR序列，所述CD3启动子序列和所述CAR序列相连，其中所述CAR序列具有胞外区域序列和胞内区域序列，所述胞外区域序列和所述胞内区域序列相连，所述胞外区域序列为抗CD19免疫球蛋白scFV片段序列，所述CD3启动子序列为SEQ ID NO:14。根据该核酸得到了该核酸编码的多肽，含有该核酸的重组载体，含有重组载体的重组细胞以及在制药中的应用。本发明利用T细胞特异的CD3启动子调控嵌合抗原受体(CAR)的表达，从而实现CAR的高效表达。

技术领域

本发明涉及基因工程领域，具体涉及一种含CD3启动子序列和CAR序列的可分离的核酸及应用，尤其涉及一种含CD3启动子序列和CAR序列的可分离的核酸、多肽、重组载体、重组细胞及其应用。

背景技术

CAR-T(Chimeric Antigen Receptor T-Cell Immunotherapy)，全称是嵌合抗原受体T细胞免疫疗法，是近年来发展起来的新的过继免疫细胞治疗手段，也是被公认为有望彻底攻克人类癌症的独特方法。CAR-T是指提取外周血或者脐带血中的T淋巴细胞，通过外源基因修饰，使T细胞表面表达识别肿瘤相关抗原的单链抗体(scFv)和T细胞活化序列的融合蛋白，经体外扩增后CAR-T细胞回输到患者体内，CAR-T细胞也会在患者体内增殖，并以非MHC(major histocompatibility complex，主要组织相容性复合体)限制性的模式杀死具有相应特异性抗原的肿瘤细胞。

然而目前的手段回输到患者体内的CAR-T容易发生基因表达沉默，限制了CAR-T免疫疗法的应用。

发明内容

本发明旨在至少在一定程度上解决相关技术中的技术问题之一。本发明利用T细胞特异的CD3启动子携带CAR基因的表达，实现高效的T细胞扩增和对肿瘤细胞的杀伤能力。与目前常用的CAR载体相比，能提高CAR-T细胞的培养制备效率，降低T细胞定植后的转基因沉默。

本申请是基于发明人对以下事实和问题的发现和认识作出的：

CAR的胞外域是单链抗体scFv(Single-chain fragment variable antibody，也称CD19)，能特异的识别肿瘤细胞的表面抗原，跨膜区连接胞外和胞内结构域，而胞内域则包含共刺激分子CD3ζ(在本发明中有时也直接称CD3)和4-1BB(也称CD137，或者41BB)，T细胞接触特异抗原活化后，表现出CAR依赖的杀伤、增殖和细胞因子释放，起到肿瘤杀伤作用。将T细胞中载入携带有CAR的载体，能够有效提高T细胞的治疗效果，其原理正是基于CAR的特殊结构。

基于以上原理，例如可以借助于转染技术，利用携带CAR的病毒载体转染T细胞，从而能够有效提高T细胞的治疗效果。而病毒载体中常常用到的是CMV启动子，这是一种病毒来源的哺乳动物通用启动子，而CMV启动子携带的基因在完成转基因和细胞定植后容易发生转基因沉默，从而导致定植后的CAR-T失效。针对这一缺陷，采用的措施包括用EF1α或actin这类强启动子替代CMV启动子，此外，法国Theravectys公司提出用人源beta-2microgobulin启动子来启动CAR基因的表达，因为该基因在APC及T细胞和NK细胞中都有较强的表达，但是这类强启动子普遍缺乏表达的谱系特异性，可能造成CAR在其他谱系(如B细胞)中的表达和刺激效应。

本发明的发明人在研究过程中发现，由于CAR-T的预期效应细胞是T细胞，而T细胞都是CD3阳性的。根据这一特性，根据T细胞自身的特性，克隆CD3启动子，用来携带CAR基因的表达，既保证了CAR表达的特异性，同时还能避免T细胞定植后转基因沉默的发生，而且相比较于已有的其他启动子，利用T细胞自身表达需要的启动子来同时启动C AR基因的表达，不会引入任何外源序列，而且可以保证高效。