[发明专利]一种可视快速检测食源性致病菌的试剂盒及其方法

说明书

本发明涉及分子生物学技术领域，具体涉及一种可视快速检测食源性致病菌的试剂盒及其方法，采用多重环介导等温扩增结合胶体金免疫层析法同时检测食品中副溶血性弧菌、沙门氏菌和单增李斯特菌三种食源性致病菌，其包括引物、LAMP扩增反应体系和胶体金免疫层析三重检测试纸；本发明将LAMP的高灵敏度和胶体金免疫层析方法快速简便的优点结合起来，同时检测分析出三种食源性致病菌，实现对所扩增的目标核酸片段的特异性检测，从而最终建立食源性致病菌的LAMP‑胶体金免疫层析快速检测鉴定的新方法。

技术领域

本发明涉及分子生物学技术领域，具体涉及一种可视快速检测食源性致病菌的试剂盒及其方法。

背景技术

食源性致病菌在各种食品中的分布广泛并且残留量很低，因此建立相应的检测方法并提高检测准确性和检测效率是保障食品安全，避免食源性疾病爆发的重要手段之一。食源性致病菌的检测方法主要有培养法、免疫学法(如ELISA以及免疫层析试纸条法)、分子生物学法(如常规PCR、荧光定量PCR、恒温扩增等方法)等。各种检测方法均有各自的优势和缺点：检测方法繁琐，检测时间长，灵敏度低，容易发生漏检和错检，传统的检测方法已无法满足目前食品快速检测的要求；相较于传统培养法检测食源性致病菌，基于免疫学和基于PCR的快速检测方法更为快速、敏感性更好，由于仪器和试剂昂贵、需专业技术人员操作，以及PCR易污染等限制了这些方法的广泛应用。

本发明为多重环介导等温扩增(LAMP)结合胶体金免疫层析法检测食源性病原菌。单管多重LAMP检测方法，达到一次性快速检测多种食源性致病菌的目的，而多重LAMP扩增产物不能像多重PCR那样通过电泳或测序来判别其检测体系中具体存在何种病原DNA，因此，本发明将环介导等温扩增的高灵敏度和胶体金免疫层析方法快速简便的优点结合起来，同时检测分析出多种食源性致病菌，实现对所扩增的目标核酸片段的特异性检测。LAMP-胶体金免疫层析法是一种灵敏度高、特异性强又简便、直观、经济的食源性致病菌检测方法，充分发挥分子生物学和免疫学两种检测方法的优长，大大提高了食源性致病菌的检测效率和准确率。

发明内容

本发明的目的是提供一种可视快速检测食源性致病菌的方法，该方法采样多重环介导等温扩增(LAMP)结合胶体金免疫层析法同时快速的检测分析出三种食源性致病菌，充分发挥分子生物学和免疫学两种检测方法的优长，大大提高了食源性致病菌的检测效率和准确率。

为实现上述目的，本发明采用的技术方案是：

本发明提供了一种可视快速检测食源性致病菌的试剂盒，该试剂盒采用多重环介导等温扩增结合胶体金免疫层析法同时检测食品中副溶血性弧菌、沙门氏菌和单增李斯特菌三种食源性致病菌，其包括引物、LAMP扩增反应体系和胶体金免疫层析三重检测试纸；

(1)引物：包括含FIP、BIP、F3、B3、LoopF和LoopB，其中BIP引物标记上FITC抗体，LoopB引物标记上荧光探针；

引物序列如下：

tlh-FIP：CTGTCACCGAGTGCAACCACTT-AACCACACGATCTGGAGCA；

tlh-BIP-FITC：GCATCACAATGGCGCTTCCC-ACCGTTGGAGAAAGTGACCTA，5’端标记荧光素；

tlh-F3：CGCTGACAATCGCTTCTCAT；

tlh-B3：GTTCTTCGCTTTGGCAATGT；

tlh-LF：CTGCATTGCTGCGTCGT；

tlh-LB-Bio：TAACCCGAACAGCTGGTTCT，5’端标记生物素；

invA-FIP：GCATCCGCATCAATAATACCG-CTCTGGATGGTATGCCCGG；