[发明专利]海洋低温(+)γ-内酰胺酶不对称水解制备(-)γ-内酰胺的方法

权利要求书

1.一种制备(-)γ-内酰胺的方法，其特征在于，采用具有立体选择性的海洋低温(+)γ-内酰胺酶，在水相体系，以(±)γ-内酰胺为底物，进行不对称水解拆分制备(-)γ-内酰胺，步骤如下：(1)微生物菌株：假交替单胞菌(Pseudoalteromonassp.DL-6)CGMCCNo.8580；(2)将步骤(1)的菌株接种于种子培养基中摇床培养，培养温度15～20℃；摇床转速160～220rpm；培养时间1～2天，得到种子液；其中，种子培养基为：酵母膏15.0～20.0g，蛋白胨5.0～10g，NaCl5.0～10.0g，MgSO₄0.05～0.2g，ZnSO₄·7H₂O1.0～5.0mg，自来水1.0L，pH为8.0～9.0，于103kpa，121℃高压蒸汽灭菌30min；(3)将步骤(2)得到的种子液接入产酶培养基中培养，在摇床转速160～220rpm，15～20℃，培养2～5天，即海洋微生物发酵生产低温(+)γ-内酰胺酶结束；其中，产酶培养基为：牛肉膏10.0～15.0g，蛋白胨5.0～10.0g，乙酰胺10～20g，Tween80 0.2～0.6g，(NH4)₂SO₄2.0～2.5g，KH₂PO₄1.5～2.0g，MgSO₄0.1～0.3g，CaCl₂0.1～0.6g，ZnSO₄·7H₂O1.4～5.0mg，自来水1.0L，pH为6.0～8.0，于103kpa，121℃高压蒸汽灭菌30min；(4)将步骤(3)的培养物离心，取上清液，得到含有海洋低温(+)γ-内酰胺酶粗酶液，低温透析浓缩得到浓缩酶液，冷冻干燥，保存备用；(5)反应体系的配制：以(±)γ-内酰胺为底物，用pH4～10、50mM磷酸盐缓冲液水相反应体系，底物浓度为5g/L～500g/L；(6)酶催化反应：在步骤(5)的单一水相反应体系中，加入步骤(4)的粗酶液100～500U/mL进行反应，反应温度为15～30℃，反应时间为5～24小时，摇床转速为100～220rmp；(7)将步骤(6)中酶催化反应之后的反应液，加入氯仿:正丁醇＝5:1(v/v)混合，震荡后离心除去蛋白，上清液采用乙酸乙酯萃取，无水硫酸镁干燥，在30～100℃下蒸发浓缩，-20～-4℃下冷却结晶，得到高纯度的(-)内酰胺，光学纯度97％-99.9％，化学纯度为96％～99％。

2.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤(1)中假交替单胞菌的菌液涂布于平板筛选培养基，20℃下培养3～5天，挑取单菌落，进行活性测定；其中，平板筛选培养基为：酵母膏10.0g，N-乙酰-L-苯丙氨酸10.0g，NH₄Cl 10.0g，Na₂HPO₄ 1.2g，NaH₂PO₄ 1.0g，MgSO₄ 0.5g，琼脂粉20g，自来水1.0L，pH为8.0，于103kpa，121℃高压蒸汽灭菌30min。