[发明专利]一种核糖体毒素及其编码基因与应用

权利要求书

1.一种基因，其特征在于，是如序列表中序列1所示的DNA分子。

2.根据权利要求1所述的DNA分子编码得到的蛋白，其特征在于：是如序列表中序列2所示的氨基酸序列组成的蛋白质。

3.含有权利要求1所述基因的重组载体、表达盒或重组菌；

所述重组载体为将权利要求1所述基因插入表达载体pPICZαA的Xho I和XbaI酶切位点间，得到表达权利要求2所述蛋白的重组载体。

4.一种利用权利要求1所述的基因制备蛋白的方法，包括以下步骤：

S1：将权利要求1所述的基因和表达载体pPICZα分别用Xho I和Xba I双酶切并纯化回收，然后利用连接酶在16℃连接，得重组载体pPICZαA-HtA；

S2：将所述重组载体pPICZαA-HtA用Sac I单酶切线性化，并用氯化锂转化法转化到毕赤酵母宿主菌中，再经过Zeocin筛选得到阳性克隆；

S3：将所述阳性克隆转接至含有1000～1500μg/mL Zeocin的YPD平板，筛选得到高Zeocin抗性的转化子，将所述高抗性转化子用BMGY培养基培养至OD₆₀₀为10～15，离心收集细胞沉淀，用BMMY培养基重悬细胞，加入甲醇并使其质量分数为1.0％～1.5％，诱导72小时收集发酵的上清液。

5.根据权利要求4所述的制备蛋白的方法，其特征在于：在步骤S3之后，还包括如下步骤：

S4：将所述上清液利用NaOH调节pH至8.0～8.5，以大于或等于15000g的转速离心10～20分钟，将获得的上清液上样到经pH8～8.5的20mM Tris-HCl缓冲液平衡后的CM阳离子交换层析柱，用5～10倍层析柱体积的pH8.0～8.5的含20mM Tris-HCl和50～100mM NaCl的缓冲液漂洗所述CM阳离子交换层析柱；

S5：用含20mM Tris-HCl和400～800mM NaCl的缓冲液洗脱所述CM阳离子交换层析柱，将得到的洗脱液利用分子量为10kDa的透析袋于10mM Tris-Cl缓冲液中透析，然后超滤浓缩。

6.根据权利要求5所述的制备蛋白的方法，其特征在于：在步骤S5之后，还包括如下步骤：

S6：将所述超滤浓缩得到的产品在-80℃下速冻，然后冷冻干燥。

7.权利要求2所述蛋白、权利要求1所述基因或权利要求3所述重组载体、表达盒或重组菌在抗虫领域中的应用。