[发明专利]一种检测样品菌种相对含量的方法

权利要求书

1.一种检测样品菌种相对含量的方法，其特征在于，所述方法步骤如下：

1)引物的设计：根据待测菌的16S rRNA或其他靶基因片段设计引物；

2)基因组的提取：对菌种样本预处理，并进行低温保存；将预处理后的样本进行初步的离心处理，再进行物理破碎处理，进行冻融酶解处理，接下来进行萃取处理，DNA过柱纯化，最后进行DNA质量检测；

所述物理破碎的步骤为：将含有样品的离心管，在12000rpm的速度下进行离心5min，去上清；在每个离心管中加入酸洗玻璃珠；加入900ul的TENS裂解液，震荡混匀；将样品离心管对称放置于组织破碎仪中进行破碎处理，频率为50HZ，时间为10min；

所述冻融酶解处理的步骤为：将经破碎处理后的样品离心管，低速离心5s；将放有样品管的浮漂置65℃的液氮水浴冻融15min；冻融结束后，速离心5s，加入10ul溶菌酶，震荡混匀置浮漂中，37℃温育1h；取出样品管，加入225ul 10％SDS及5ul蛋白酶K，56℃温育30min，再65℃温育30min；取出样品管，加入225ul 10％SDS及5ul蛋白酶K，56℃温育30min，再65℃温育30min；

所述DNA过柱纯化的步骤为：

取离心管进行离心处理，速度为14000rpm，时间为30min；离心后，若沉淀目视可见，则吸走全部的上清液，并丢弃；若未见沉淀，则小心吸取上清液；然后加入100uL ElutionBuffer，漩涡震荡，直至沉淀溶解，得到DNA溶液；

在DNA溶液中加入500uL Binding Buffer，5uL NaAc，振荡10s，短暂离心5s，使管盖和管内壁处无液体；将离心管中液体全部转移至DNA分离吸附柱中，静置5min；

将DNA分离吸附柱离心处理，速度为10000rpm，时间为1min，弃滤液，在吸附柱中加入500-uL Washing Buffer，静置1min；然后再次进行分离吸附柱离心处理，速度为10000rpm，时间为1min，弃滤液，在吸附柱中加入500-uL Washing Buffer，静置1min；

然后第三次进行分离吸附柱离心处理，速度为10000rpm，时间为1m in；

进行第四次将DNA分离吸附柱离心处理，速度为14000rpm，时间为2min；后将DNA吸附柱置于新的离心管中，室温放置5min；

在每个分离吸附柱中加入60uL经预热至55℃的Elution Buffer，室温静置5分钟；离心处理，速度为10000rpm，时间为3min；

所述DNA质量检测包括对DNA进行电泳检测和纯度检测；所述电泳检测的步骤为:使用1％的琼脂糖凝胶电泳，取2uL样品，取2uL的λDNA/HindⅢ，在电压120V，时间30min的条件下，对提取的DNA和PCR产物进行条带检测；所述纯度检测的步骤：使用紫外分光光度计，对提取的DN A进行纯度检测，当A280/A260比值为1.8-2.0，A260/A230大于2.0时，则表明DNA纯度较好；

3)荧光定量PCR：设置荧光阈值、基线和PCR反应条件，测量得到样品的Ct值原始数据；

4)NGS16S测序：使用通用引物扩增出样品中所有细菌的16S，建库并测序；

5)NGS分析：载入测序数据文件；去除测序和PCR的错误数据；合并同类项；提取数据；对齐数据；预分簇；剔除嵌合体；与数据库对比并聚类；输出分析结果；对样品中的16S进行归类分析；

6)预测模型的建立：将样品NGS的分析结果与样品的Ct值进行关联，运用相关编程和数学工具建立拟合模型，用于计算qPCR实验原始数据并得出最终待测菌相对含量的结果。

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述初步的离心处理步骤为：

将样本预处理后的离心管，进行短暂的离心处理：速度为4000rpm，时间为30s，使样本处于离心管的底部；在离心管中加入1000ul的10×Tris-EDTA；漩涡震荡使样本混匀成悬浮液。