[发明专利]一种DNA病毒重组体的构建方法

说明书

本发明公开了一种DNA病毒重组体的构建方式，属于生物技术领域。本发明所述的DNA病毒重组体的构建方式，具体包括如下步骤：1）PCR分别扩增置换位点基因两侧翼1000‑2000bp的同源片段；2）以含GFP基因的质粒为模版扩增GFP荧光蛋白全基因序列；3）置换同源质粒的构建；4）GFP荧光病毒的构建；5）病毒重组体的构建。本发明通过In‑fusion技术大大简化了构建重组病毒的步骤，使得本发明的构建方法实现DNA重组病毒的快速构建，同时不引入其他的外源核酸片段。该方法适用于抗肿瘤基因病毒治疗，病毒学研究，病毒载体开发，以及疫苗研究等需要构建DNA病毒重组体的各种情况。

技术领域

本发明属于生物技术领域，特别涉及一种DNA病毒重组体的构建方式。

背景技术

双链DNA病毒包括腺病毒，痘病毒，疱疹病毒等，这些病毒在生物工程领域被广泛地应用。不管是抗肿瘤基因病毒治疗，病毒学研究，病毒载体开发，还是疫苗研究都经常需要构建病毒重组体。

目前DNA重组病毒的构建方法主要有两种。

一种是应用细菌人工染色体Bacterial Artificial Chromosome（BAC）系统，BAC是指一种以F质粒（F-plasmid）为基础建构而成的细菌克隆载体，常用来克隆150kb左右的DNA片段。典型的BAC载体有一个复制起点，BAC复制所必需的基因(如repE)，及控制复制速度的基因(如parB)。抗生素耐药性标记(如氯霉素)或其他可用于病毒BAC阳性菌落筛选的也必须包含在BAC载体中。用于病毒重组的BAC系统，还需要携带有att等重组相关序列，这样就可以在生成重组病毒时删除大部分的BAC载体序列。要构建BAC病毒，还需在BAC载体序列上插入2000bp与目的病毒同源的碱基对片段。为了分离BAC病毒，BAC载体也应该携带一个可选择的标记物(如GFP)。此外，为了在细菌体内实现同源交换，进行病毒重组体的构建，通常还需要导入可以表达DNA重组酶的辅助质粒。

病毒BAC构建的具体做法是在感染病毒的细胞内导入含有病毒核酸同源序列，att等重组相关核酸序列，及用于筛选的荧光蛋白序列的线性化BAC载体，通过同源交换获得含有BAC核酸序列的荧光病毒。在病毒核酸复制成环时，提取核酸，导入DH10β细菌中。在构建病毒重组体时，是先在细菌内完成病毒核酸的重组，再提取重组BAC病毒核酸，体外去除BAC序列后转染细胞获得重组病毒。而构建的病毒将依然携带有部分外源序列如基因重组过程中发挥重要作用的att序列。这些二百多bp的序列可能对邻近的病毒基因的转录表达造成影响，从而使病毒的毒力及致病性发生变化。商品化的腺病毒载体，杆状病毒载体多通过此类方法构建。像CMV疱疹病毒，痘病毒这样拥有更大基因组的病毒，往往需要删除一些非必须核酸序列来提高病毒BAC的成功率。

另一种重组病毒的构建方法主要是基于在感染细胞内病毒核酸的同源置换。外来核酸的插入有可能影响其他基因的转录，使用该方法可以达到不带入额外基因的情况下，对病毒基因组进行改造。疱疹病毒的同源重组是比较容易发生的，病毒基因ICP8，UL21参与了病毒的重组，这为通过同源构建重组病毒奠定了基础。本发明就是基于病毒的同源交换来构建重组病毒。该方法的另一个优点是不受重组位点的限制。荧光蛋白基因可以插在基因内，对于要置换的基因为必需基因的情况，可以将荧光蛋白基因插在置换基因的上游侧翼或下游侧翼，避开对基因转录的影响。

综上，可知现有技术的缺点：操作比较繁琐；应用BAC系统，牵涉到病毒BAC的构建，其方法繁琐且成功率低。重组病毒的获得，还需要再进行新的构建，筛选，转化。此外，不管是Gateway重组系统，还是Cre／loxP重组系统，其最终获得的病毒重组体都带有外源核酸序列。现有的通过同源交换构建重组病毒的方法，步骤也较为繁琐，多是应用内切酶等方法进行核酸的连接来构建用于基因重组的质粒，限制了核酸片段的自由组合。

发明内容